系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒技术方案

本发明专利技术公开了一种系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒，所述生物标志物是人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的用于SLE诊断的试剂盒包含：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的一组PCR引物以及如SEQ ID NO.4所示序列的测序探针。本发明专利技术克服了现有SLE早期诊断中检测技术方法的不足，仅需要抽取不超过1ml的患者外周血，检测如SEQ ID NO.1所示DNA序列中两个CG位点的甲基化水平。本发明专利技术的试剂盒特异性和灵敏度高，检查耗时短，操作简单，需要的标本量少，易于临床上广泛推广，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
系统性红斑狼疮生物标志物及其诊断试剂盒
本专利技术涉及一种系统性红斑狼疮外周血DNA甲基化标志物以及一种用于系统性红斑狼疮的诊断试剂盒。
技术介绍
系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus，SLE）是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。临床表现为肾脏、神经精神系统、血液系统等多器官受损。如果能够在SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断对于SLE的防治、改善患者的生活质量、提高患者生存率具有重大意义。然而，目前的生物学诊断标志物大多是在器官受损后出现的生化和免疫学改变，无法对SLE患者器官受累进行早期诊断。近年来，表观遗传学标记物研究发展迅速，许多表观遗传标志物如DNA甲基化标记物、血清microRNA标记物被筛选和鉴定，这些标记物对于疾病的早期诊断和预后判断具有重要价值。已有大量文献证实DNA低甲基化在SLE患者CD4+T细胞异常活化及SLE发生发展中发挥重要的作用。目前，已经鉴定的在SLE患者CD4+T细胞中发生低甲基化的基因包括CD11a、CD70、CD40L和Perforin等。这些基因的低甲基化导致其过度表达，从而诱导T细胞自身反应性活化，导致SLE发生。其中CD11a和CD70基因启动子调控序列的甲基化已经被证明可以用于SLE的辅助诊断。然而，这种方法限制在检测外周血CD4+T细胞基因组中的CD11a和CD70基因甲基化水平。这就要求我们首先要收集较多的患者外周血样本（约20ml左右），然后利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离外周血中的CD4+T细胞。由于抽取患者血液样本较多，患者的医从性较低；而且CD4+T细胞分选的实验成本较高、实验耗时较长，增加了患者的负担。另外，检测CD11a和CD70基因甲基化以往采用克隆测序法、自制芯片法，耗时较长，且无法给出一个精确的甲基化定量水平，给临床上推广应用带来了困难。目前临床上尚无一种高敏感性高特异性的SLE诊断指标，即使是自身抗体如抗ANA抗体，其对SLE的诊断敏感性为95%，但诊断特异性相对较低65%。为此，患者必须检查许多实验室指标联合辅助诊断SLE，导致疾病的诊疗成本大大增加，加重了患者的负担。因此，开发新的SLE诊断标志物十分必要，对提高SLE的诊疗水平具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对传统的系统性红斑狼疮实验室检查指标灵敏度或特异性不高的问题，克服现有技术方法的不足，提供一种新的高灵敏高特异性的SLE患者外周血DNA甲基化标志物，并相应提供一种用于诊断SLE的灵敏度和特异性均较高的检测试剂盒。专利技术人经过长期研究发现，发生于基因组上的表观遗传学修饰在SLE的发生、发展中发挥重要作用，一些异常的DNA甲基化修饰可能作为SLE早期诊断的标志物。通过对大样本SLE患者、健康人、类风湿性关节炎患者外周血细胞中IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的序列进行DNA甲基化检测，证实其包含的两个CG位点的甲基化水平分别在SLE患者中较健康对照、类风湿性关节炎患者显著降低，这两个CG位点低甲基化用于诊断SLE的灵敏度和特异性均很高。本专利技术所述一种高灵敏、高特异性的SLE患者外周血DNA甲基化标志物是人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段DNA序列，即位于人类基因组1号染色体79,085,190-79,085,311段（人类基因组数据hg19版本），其DNA序列如SEQIDNO.1所示。上述DNA序列包含两个CG位点，其甲基化水平在SLE患者外周血细胞中较健康对照显著降低，与疾病对照类风湿性关节炎相比亦明显降低。本专利技术还提出SEQIDNO.1所定义DNA序列的生物标记物在制备SLE诊断试剂中的应用，该应用包括测定受试者外周血细胞中SEQIDNO.1所定义DNA序列包含的两个CG位点的甲基化水平。具体来说，可以通过PCR扩增目的DNA片段并测序后通过软件分析测序结果来判断受试者外周血中的IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内DNA序列的甲基化水平，包括下述步骤：（1）抽提受试者外周血全基因组DNA；（2）测定抽提的基因组DNA浓度；（3）亚硫酸盐处理基因组DNA；（4）特异性PCR引物扩增待测DNA片段；（5）电泳检测PCR产物；（6）对PCR产物进行测序；（7）分析测序结果，获得待测序列中包含的两个CG位点的甲基化水平。本专利技术的另一目的还在于提供一种用于SLE诊断的试剂盒，该试剂盒包含SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的一组PCR引物以及如SEQIDNO.4所示的测序探针，以及任意需要的试剂或介质，如外周血细胞基因组DNA抽提、DNA浓度测定、亚硫酸氢盐处理、PCR分析、电泳、焦磷酸测序分析。具体来说，所述试剂盒可以进一步包括一种或多种选自由以下所组成的组中的成分：脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲剂、稳定剂、热稳定DNA聚合酶和标记物，包括荧光标记物、化学发光标记物和放射性标记物。本专利技术检测SEQIDNO.1序列两个CG位点的甲基化水平需要设计特异性PCR引物扩增SEQIDNO.1所述DNA片段，引物设计是根据包含SEQIDNO.1所述目的DNA序列及该段序列上下游200bp核苷酸的DNA序列设计，引物序列为：上游引物5'-TGTGGATAGTGATAATTTGTTATAAAGTAA-3'（如SEQIDNO.2所示）；下游引物5'-AACCTCATCCAATCTTAAAACACTTATA-3'（如SEQIDNO.3所示），下游引物的5'端用生物素biotin标记。本专利技术用于焦磷酸测序检测目的DNA片段中的CG位点甲基化水平需要特殊的探针，根据IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的SEQIDNO.1所述序列设计测序探针，序列为：5'-AATGTTGTTATTTTATTTTAGATAG-3'（如SEQIDNO.4所示）。本专利技术利用Illumina公司的DNA甲基化芯片（Illumina450K）在国际上首次筛选SLE患者外周全血细胞中差异DNA甲基化修饰基因。通过大规模临床样本筛查、利用最新的遗传学和表观遗传学检测技术，寻找到SLE患者的早期诊断标记物，建立相应的检测方法，从而开发出SLE早期诊断试剂盒。通过与正常人外周血样本相比，专利技术人发现IFI44L是SLE患者外周血中DNA甲基化改变最显著的基因之一。专利技术人通过扩大样本也进一步证实SLE患者外周血细胞中IFI44L基因起始位点上游1500bp内的一段序列DNA甲基化水平较正常人和类风湿性关节炎（RA）患者显著降低。IFI44L属于Ⅰ型干扰素通路，是一种干扰素诱导基因。Ⅰ型干扰素通路在SLE发病过程中起十分重要的作用。因此，IFI44L可以作为SLE诊断的标志。本专利技术所提供的SLE诊断试剂盒克服了现有SLE检测技术方法的不足，仅需要抽取不超过1ml的患者外周血，从SLE患者外周血中找到DNA甲基化标志物，因此显著提高患者的医从性。本专利技术的试剂盒特异性和灵敏度高，检查耗时短，操作简单，需要的标本量少，易于临床上广泛推广，应用前景广阔。利用焦磷酸测序仪配合特异性引物和探针可以大大缩短DNA甲基化的检查时间，大大了提高实验室检查的效率和检查结果的准确性和特异性（均可达到90%以上）。该项新技术和产品开发与应用将对于提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于系统性红斑狼疮早期诊断的生物标记物，其特征在于该生物标记物为位于人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段DNA序列，该段DNA序列位于人类基因组1号染色体79,085,190‑79,085,311段，其序列如SEQ ID NO.1 所示。

【技术特征摘要】
2015.02.27 CN 20151008961841.一种用于系统性红斑狼疮早期诊断的生物标记物，其特征在于该生物标记物为位于人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段DNA序列，该段DNA序列位于人类基因组1号染色体79,085,190-79,085,311段，其序列如SEQIDNO.1所示，该SEQIDNO.1序列中所包含的两个CG位点的低甲基化水平指示所述系统性红斑狼疮的存在。2.SEQIDNO.1所定义核酸序列的生物标记物在制备SLE诊断试剂中的应用，该应用包括测定受试者血液中IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内SEQIDNO.1序列中所包含的两个CG位点的甲基化水平。3.如权利要求2所述的SEQIDNO.1所定义核酸序列的生物标记物在制备SLE诊断试剂中的应用，该应用包括下述步骤：（1）抽提受试者外周血全基因组DNA；（2）测定抽提的基因组DNA浓度；（3）亚硫酸盐处理基因组DNA；（4）特异性PCR引物扩增SEQIDNO.1所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，赵明，S·阿姆，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43