本发明专利技术公开一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，该扩增检测试剂包括：一对可以同时扩增13号和5号染色体上特异重复序列的引物，以及分别检测上述13和5号染色体特异重复序列扩增量的2条荧光探针；另一对可以同时扩增18号和9号染色体上特异重复序列的引物，以及分别检测上述18号和9号染色体特异重复序列扩增量的2条荧光探针。本发明专利技术所述试剂盒能通过13号和5号染色体的2-△△CT13-5值以及18号和9号染色体的2-△△CT18-9值同时独立地分别检测出13号和18号染色体的数目，结果准确、可靠，且灵敏度高、特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染 色体数目的试剂盒，属于分子生物学领域。
技术介绍
18-三体综合症又称Edwards综合征。本病在新生婴儿中的发生率为1/3500~ 1/8000,多发生在年龄较大的父母亲，52%超过35岁。女孩比男孩发生率高。18-三体综合 征的特征表现为生长迟缓、上睑下垂、眼睑畸形、耳位低、小嘴、小下颏、皮肤斑点、示指超过 中指并握紧拳头、并指（趾）畸形、摇篮底足、足趾大而短、室间隔缺损、脐疝或腹股沟疝、胸 骨短、小骨盆和肌张力增高，偶有癫痫发作、严重精神发育迟滞等，常死于婴儿早期。 13-三体综合征又称Patau综合征。本病在新生儿中发病率为1/4000~1/10000， 女性明显多于男性，发病率随孕母年龄增高而增加。本病主要特征为严重智能低下、特殊面 容、手足及生殖器畸形，并可伴有严重的致死性畸形，90 %患儿在一岁内死亡。 目前，该类染色体疾病尚无有效的治疗方法，因此，进行产前诊断防止患儿的出 生是预防染色体疾病发生的主要方法。羊水细胞培养、染色体核型分析是产前诊断的经典 方法（Caspersson T, Zech L, Johansson C, et al. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents.Chromosoma, 1970, 30(2) :215-227.),但是， 该方法一般需要两周以上才能得到检测结果，容易导致孕妇及其家庭承受极大的心理 压力。荧光原位杂交（FISH)技术应用于产前快速诊断，无需进行细胞培养，实现了染 色体疾病的快速诊断（Ho SSY，Chua C，Gole L，et al. Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies using microfluidics-fluorescence in situ hybridization · Prenatal Diagnosis, 2012, 32 (4) : 321-328.)，但是由于该技术操作繁 琐并且要求具有良好的技术专业性，使得该技术不能大量的进行临床标本的应用。因此，需 要建立更加快速而有效的产前诊断方法来弥补以上方法的一些缺陷和不足。 随着分子生物学的发展，目前已出现了几种快速分子诊断非整倍体的方法。基 于STR的QF-PCR方法是目前应用最广的一种方法，该方法能实现非整倍体的准确检测 (Atef SH, Hafez S, Helmy S, et al. QF-PCR as a Rapid Technique for Routine Prenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies. Pediatric Research, 2011, 70:412-412.), 该 技术的主要缺点是诊断需要依靠多态性位点，而多态性位点可能在某一人群能较好的 进行诊断，而因为种族的差异可能会出现在其它人群中出现无法进行诊断的情况（Mann K, Donaghue C, Fox SP,et al. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy.Eur J Hum Genet,2004，12:907-915·);并且，其在 PCR 扩 增后还需要毛细管电泳分析其片段片度，因此，仪器及试剂的费用也限制了该方法的广 泛应用。多重连接探针扩增（MLPA)技术最开始应用于基因拷贝数的变化，目前也应用 于非整倍体疾病的诊断（Slater HR, Bruno DL, Ren H，et al· Rapid, high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method(MLPA) · Journal of medical genetics, 2003, 40(12) :907-912.)，由于该技术需要杂交过夜、连 接以及产物的后续毛细管电泳分析等步骤，实验相对繁琐且后续分析昂贵费用影响了该 技术的广泛应用（Willis AS, Veyver I，Eng CM. Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)and prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 2012 ;32:315-320.)〇 实时荧光定量PCR方法诊断非整倍体不需要PCR后处理或电泳检测，简便、快 速，整个操作及结果的判定可在4小时内完成；而且数据的读取完全由仪器进行，排除 了主观因素的影响，另外几十个标本可以一次完成，为开展大规模的产前筛查提供了技 术保障。目前的研究主要是采用不同染色体间的特异性基因进行诊断，如21号染色体 的诊断（Zimmermann B, Holzgreve ff, Wenzel F, et al. Novel real-time quantitative PCR test for trisomy21· Clinical chemistry, 2002,48(2):362-363.)，以及 21 号和 18 号染色体的诊断（Zimmermann B G, Dudarewicz L. Real-time quantitative PCR for the detection of fetal aneuploidies. Prenatal Diagnosis. Humana Press，2008:95-109;眭建忠，张慧敏，孙筱放.多重实时定量PCR快速诊断唐氏及爱德 华综合征.中华医学遗传学杂志，2010(4) :449-452.)。但是，由于采用两对引物分别 扩增不同的片段，很微小的退火温度的变化或DNA质量的差异都会引起假阴性或假阳性的 结果，从而导致结果的不准确性（Helmy SM, Ismail S，Bassiouni R，et al. Sensitivity of DCSR3/GAPDH ratio using quantitative real-time PCR in the rapid prenatal diagnosis for down syndrome· Fetal Diagn Ther，2009,25 (2):220_223.)〇 基于短串联片段（STR)的 QF-PCR 法的相关专利 CN103103267A、CN101323877A、 CN104818323A、CN104651488A、CN103555849A等均采用扩增STR分子标记，然后采用遗传分 析仪（测序仪）的方法进行片段分析，实现了 21号以及其它染色体的诊断，但是该类方法 需要PCR反应后分析，操作繁琐且需昂贵的遗传分析仪，不利于方法的广泛推广应用。 目前尚未见有采用相似序列分子标记的实时荧光定量PCR技术，实现单管四色双 重相对定量同时检测13号和18号染色体数目的方法或技术的相关本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单管四色双重相对荧光定量PCR技术快速检测人13号和18号染色体数目的试剂盒，包括扩增检测试剂，其特征在于：所述的扩增检测试剂包括：(1)同时扩增13号染色体特异重复序列chr13与5号染色体特异重复序列chr5的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；(2)特异性检测13号染色体特异重复序列chr13的Taqman探针chr13‑Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示；(3)特异性检测5号染色体特异重复序列chr5的Taqman探针chr5‑Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：4所示；(4)同时扩增18号染色体特异重复序列chr18与9号染色体特异重复序列chr9的引物对，其碱基序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；(5)特异性检测18号染色体特异重复序列chr18的Taqman探针chr18‑Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：7所示；(6)特异性检测9号染色体特异重复序列chr9的Taqman探针chr9‑Probe，其碱基序列如SEQ ID NO：8所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙雷，樊祖茜，
申请(专利权)人：钦州市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广西;45
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