本发明专利技术公开了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，步骤包括：（1）冷沉淀与组分I同时投料、溶解；（2）DEAE Sephadex A-50 凝胶吸附；（3）S/D病毒灭活；（4）阴离子交换柱层析；（5）层析穿透液经两步低温乙醇沉淀纯化、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得人纤维蛋白原；（6）层析洗脱液进一步疏水柱层析；（7）疏水柱洗脱液经超滤、纳米膜过滤、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得高纯人凝血因子VIII。本发明专利技术工艺将两种原料均含有的FVIII与Fg同时提取出来，大大提高了两种产品的得率，其中人凝血因子VIII可达20万IU/吨血浆，人纤维蛋白原超过2000瓶/吨血浆，均远高于传统工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物制药领域，涉及一种血液制品的制备，具体讲是涉及一种同时制备 高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法。
技术介绍
人凝血因子VIII (FVIII)是在肝脏中合成的人体凝血因子之一，有2332个氨 基酸残基，由两条肽链所组成，重链分子量为90~200kDa ;轻链分子量为80kDa，二条 肽链间由Ca2+连接。在人体内的半衰期8~12小时，血浆中的含量仅为0. 05~0. lmg/ 升。FVIII缺乏会导致甲型血友病发生，该病是一种遗传性疾病，患者多为男性，发病率约 1/10000~1/5000,患者出血部位集中于关节、肌肉和内脏。其中，关节反复出血导致骨骼变 形，肌肉萎缩；而内脏和颅内出血则会危及生命。甲型血友病因属遗传性疾病，目前尚无根 治的方法，只能通过输注F W制剂进行替代性治疗，只要定期输注F W制剂，甲型血友病患 者完全可以像正常人一样生活。 人纤维蛋白原（human fibrinogen，简称Fg),是一种含2964个氨基酸、具有凝血 功能的蛋白质，由肝脏合成，它是人体所有凝血因子中含量最大的一种，血浆中含量2~4 克/升，分子量340KD，半衰期4~6日，等电点5. 10-5. 50,沉降系数7. 70-7.90。Fg由α、 β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。人体凝血的最后阶段是在凝血酶作 用下，Fg的α链与β链分别释放出Α肽与Β肽，生成纤维蛋白单体，进一步在Ca2+与活化 的XIII因子作用下，单体之间以共价键相连，变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块，从而完成 凝血过程。Fg缺乏会导致各类凝血方面的疾病，常见的包括：先天性纤维蛋白原减少或缺 乏症，以及因肝损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、外伤、产后大出血、大手术、内出血等导 致的后天性纤维蛋白原缺少症。因先天因素引起的Fg减少或缺乏症，补充Fg是目前唯一 可靠的治疗方法，而对于后天因素引起的Fg减少或缺乏，根据病因的不同，也需输注不 同剂量的Fg。Fg除直接参与凝血过程外，还可介导血小板聚集，影响血液粘度，是心、 脑血管病发病的重要危险因素，在动脉粥样硬化的形成及肿瘤血行转移等病理过程中也起 重要作用。 近年来，一种具有高效止血功能的外科用血液制品一一人纤维蛋白粘合剂在临床 上的应用越来越广泛，也使得作为该药配伍之一的高浓度人纤维蛋白原的需求量大增.人 纤维蛋白粘合剂所用的Fg与常规静脉输注的Fg很大的不同，主要体现在前者具有很高的 蛋白浓度，至少是后者(一般为2. 5%)的二倍或者更高。 Fg制品最大的问题在于冻干粉复溶时间长且溶解时需在30_37°C的水浴中进行， 另一个问题是容易产生蛋白析出及蛋白颗粒悬浮，这给临床使用带来了不便，譬如必须提 前从冰箱里取出置于水浴中，静脉输注时需配备过滤装置。低浓度人纤维蛋白原尚且如此， 高浓度人纤维蛋白原的复溶就更困难了。因此用常规的人纤维蛋白原生产工艺很难制备出 合格的高浓度纤维蛋白原产品。 目前，国内血制品公司供应市场的F VID产品数量十分有限，患者经常面临无药可 用的情况，严重危害患者的健康和生命安全。国内目前血制品厂家的FVIII制备工艺得率 普遍较低，一般不高于10万IU/吨血浆（FVIII含量一般为70~80万IU/吨血浆)，同时产 品纯度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外产品的外观欠佳，冻干粉不成饼状，复溶后乳光 较重，有的还有蛋白析出。 目前我国也仅有少数几家血制品公司具有人纤维蛋白原的生产能力，但产量均不 大，有的公司生产断断续续，基本处于停顿状态，因而纤维蛋白原在临床上也处于供应不足 的状态，作为人纤维蛋白粘合剂配伍的高浓度人纤维蛋白原，由于技术难度较高，国内仅 个别厂家有能力生产。 传统的生产工艺，大都是用冷沉淀生产人凝血因子VIII，用组分I生产人纤维蛋 白原，这种工艺的缺点在于，冷沉淀中含有的人纤维蛋白原（约占血浆Fg的20%)被当作生 产废料扔掉了；同样地，组分I中含有的大量FVIII也未回收利用而白白损失。 鉴于此，本专利技术开发了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料，同时制备高纯FVIII 与人纤维蛋白原的新工艺，降低了劳动强度，缩短了生产周期，大大提高了 FVIII与Fg的得 率与纯度，明显改善了人纤维蛋白原的品质，使得高浓度纤维蛋白原的外观得到明显改善， 复溶时间大大缩短，可以大规模进行生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、生产成本 低及生产效率高的同时制备人凝血因子VIII及纤维蛋白原的方法。 1. -种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：生产 流程包括如下步骤： (1) 冷沉淀与组分I沉淀制取 将新鲜冰冻血浆融化，保持血浆温度在1-3°C，离心得到冷沉淀，保持0-5°C，暂存；在 去冷沉淀血浆中加入-20°C以下的低温95%乙醇，使血浆中乙醇含量约7-9%，调节PH值至 6. 80-7. 00,在-1~-3°C下离心得到组分I沉淀；然后立即将冷沉淀与组分I沉淀合并在一 起，切成碎块； (2) 冷沉淀与组分I沉淀共溶解并压滤 按1 :10~20的重量比，将切成碎块的新鲜冷沉淀及组分I沉淀一起投入预先配制的溶 解缓冲液1中，温度控制在15_30°C，搅拌2. 5-5小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生 产的Supradur 50P滤板串联0. 45Mm滤芯压滤，收集澄清滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗 滤板及滤芯； (3) DEAE Sephadex A-50凝胶吸附并过滤 在步骤（2)收集的滤液中加入预先用65°C以上的热注射用水溶胀后用25°C以下的冷 注射用水冷却再用步骤（2)所述溶解缓冲液1平衡的DEAE Sephadex A-50凝胶，按凝胶 溶胀前的重量(干重)计，凝胶的加入量为0. 5-1. 5克/kg溶解缓冲液1 ;凝胶加入到滤液后 缓慢搅拌45-75分钟，后静置5-10分钟；然后过滤，收集滤液； (4) S/D病毒灭活 在步骤（3)收集的滤液中加入Tween80至1.0% (wt%)，TNBP (磷酸三丁酯）至0.3% (wt%)，搅匀后升温至24-26°C，后保温6-8小时，然后用0. 45Mm滤芯过滤，收集滤液； (5)阴离子交换柱层析 步骤（4)收集的滤液上阴离子交换柱进行层析，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡；上 柱过程中，收集穿透液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，将冲洗液并入穿透液中；后 用洗涤缓冲液1洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶 液，及时用〇.45μπι滤芯进行过滤，收集滤液；洗脱液的滤液按照以下6A-11A步骤进行，而 流穿液按6B-11B步骤进行； (6A)疏水柱层析；以上洗脱液滤液中加入氯化钠至1. 8M-2. 5M,然后上疏水柱，柱子 预先用平衡缓冲液2充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2洗 涤柱子，再用洗脱缓冲液2洗脱，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用0. 45Mm或0. 22Mm滤 芯过滤，收集滤液； (7A)用10K~30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-6倍，再浓缩至凝血FVIII 活力高于35IU/ml;本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：生产流程包括如下步骤:（1）冷沉淀与组分I沉淀制取将新鲜冰冻血浆融化，保持血浆温度在1‑3℃，离心得到冷沉淀，保持0‑5℃，暂存；在去冷沉淀血浆中加入‑20℃以下的低温95%乙醇，使血浆中乙醇含量约7‑9%,调节PH值至6.80‑7.00，在‑1~‑3℃下离心得到组分I沉淀；然后立即将冷沉淀与组分I沉淀合并在一起，切成碎块；（2）冷沉淀与组分I沉淀共溶解并压滤按1：10~20的重量比，将切成碎块的新鲜冷沉淀及组分I沉淀一起投入预先配制的溶解缓冲液1中，温度控制在15‑30℃，搅拌2.5‑5小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生产的Supradur 50P滤板串联0.45µm滤芯压滤，收集澄清滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗滤板及滤芯；（3）DEAE Sephadex A‑50 凝胶吸附并过滤在步骤（2）收集的滤液中加入预先用65℃以上的热注射用水溶胀后用25℃以下的冷注射用水冷却再用步骤（2）所述溶解缓冲液1平衡的DEAE Sephadex A‑50凝胶,按凝胶溶胀前的重量（干重）计，凝胶的加入量为0.5‑1.5克/kg溶解缓冲液1；凝胶加入到滤液后缓慢搅拌45‑75分钟，后静置5‑10分钟；然后过滤，收集滤液；（4）S/D病毒灭活在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80 至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯） 至0.3%（wt%），搅匀后升温至24‑26℃，后保温6‑8小时，然后用0.45µm滤芯过滤，收集滤液；（5） 阴离子交换柱层析步骤（4）收集的滤液上阴离子交换柱进行层析，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡；上柱过程中，收集穿透液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，将冲洗液并入穿透液中；后用洗涤缓冲液1洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液,及时用0.45µm滤芯进行过滤,收集滤液；洗脱液的滤液按照以下6A‑11A步骤进行，而流穿液按6B‑11B步骤进行；（6A）疏水柱层析；以上洗脱液滤液中加入氯化钠至1.8M‑2.5M,然后上疏水柱, 柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2洗脱，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用0.45µm或0.22µm滤芯过滤，收集滤液；（7A）用10K~30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4‑6倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；（8A）调节FVIII含量至所需值（一般规格为20‑30IU/ml），加入稳定剂，后调PH值至6.50‑7.50；（9A）用0.1µm滤芯串联15‑20纳米滤芯进行除病毒过滤（10A）用0.22µm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；（11A）冻干；（12A）干热病毒灭活将人凝血因子VIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；（6B） 将流穿液温度降至‑2~0℃时，缓慢加入‑20℃以下的低温95%乙醇溶液至浓度为7‑9%（V/V）,调解PH值至6.80‑7.20，保持温度‑3.0‑0℃，均匀搅拌1.5‑3小时后离心，得到第一次Fg沉淀，立即切碎；（7B）按1：10‑20的稀释比，将以上切碎的新鲜Fg沉淀投入预先配制的溶解缓冲液2中溶解，在20‑30℃下均匀搅拌2‑3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0µm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液2后洗滤芯，收集滤液；（8B）将滤液降温至‑1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于‑20℃）至7‑9%；搅拌2‑3小时，低温（‑2‑0℃）离心，得到第二次Fg沉淀，立即切碎；（9B）根据终产品的蛋白浓度要求（一般为2.5‑6.0%），将以上切碎的新鲜沉淀投入预先配制的溶解缓冲液3中，在20‑30℃下搅拌0.5‑2小时，后调节蛋白浓度至所需值，调PH值至6.50‑7.50，用0.45µm的滤芯过滤并用溶解缓冲液3后洗滤芯，收集滤液；（10B）除菌过滤并分装；（11B）冻干；（12B）干热病毒灭活将人纤维蛋白原冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春洲，
申请(专利权)人：上海洲跃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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