本发明专利技术提供了以沙门氏菌菌毛为载体的HIV-4E10表位疫苗，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过两步重叠PCR法构建了重组质粒p HSG-4E10，基因置换技术将HIV-4E10中和表位置换到沙门氏菌的细聚合菌毛agfA的A6氨基酸位置上，获得能稳定高效表达4E10表位蛋白的重组沙门氏菌ST-4E10。本发明专利技术研究发现ST-4E10的LD50为1×109.83CFU，其感染小鼠后在小鼠各脏器中均有明显分布，能广泛刺激机体的免疫系统并引起免疫应答，产生针对HIV-14E10表位的中和抗体和特异性T细胞，诱导较高的细胞因子水平，可见ST-4E10可作为HIV的候选疫苗，具有良好的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体地，涉及一种以沙门氏菌细聚合菌毛agfA为 载体、含有外源基因 HIV-4E10的重组沙门氏菌，以及以该重组沙门氏菌为有效成分的表位 疫苗。
技术介绍
HIV-1感染机体后能够刺激宿主细胞产生体液和细胞免疫应答，因此学术界普遍 认为，有效预防HIV-1感染的疫苗必须同时具备诱导机体产生病毒特异性的体液免疫和细 胞免疫的双重能力。而事实上，虽然HIV疫苗的研究由来已久，但随着研究的深入，人们发 现要研制具备上述特性的理想疫苗还面临着许多困难：其中最关键的问题是HIV病毒变异 性高。HIV基因变异速度快，在病毒感染过程中抗体中和表位和CTL表位的变异使病毒快速 逃避机体免疫系统的监视，导致疫苗的效力降低，所以如何在快速变异的病毒分子中筛选 出能够诱导广泛中和抗体的保守性抗原是开发艾滋病疫苗的关键。为解决这个问题，近年 来以保守的包膜主要中和表位（principle neutralizingdeterminants，PND)为基础的表 位疫苗应运而生。研究结果表明，表位多肽疫苗能够诱导机体产生针对不同HIV-1毒株的 广谱中和抗体，是一种很有前途的疫苗形式。由于大多中和表位仅由几个或几十个氨基酸 组成，免疫原性较差，因此如何提高表位的免疫原性并能诱导能够中和多个HIV-1分离株 抗体反应的表位疫苗是目前研究的重点。 HIV-1保守的广谱中和表位主要集中在跨膜蛋白gp41的近膜端胞外区（MPER)， MPER主要含有3个构象依赖性抗原决定簇（aa579-604, aa619-648, aa644-663)，含有2F5、 4E10和Z13三个具有广谱中和活性的抗原表位。虽然从病人体内分离出的抗体可以中和高 度多样化的HIV-1分离株，但研究表明以这3个表位研制的疫苗却很难诱生出具有广谱中 和活性的中和抗体（BNabs)反应。4E10是目前中和作用最广泛的HIV单克隆抗体。其抗原 核心表位被证实为NWFDIT基序，但利用抗原表位氨基酸未能诱导产生有效的4E10的中和 抗体。以往MPER抗体的脂质结合性和自身反应性是其显著特征，也是疫苗诱导此类抗体的 重要阻碍，但4E10表位可能是HIV表位疫苗不可或缺的表位之一。所以对于4E10表位疫 苗而言可能不仅需要天然4E10表位的呈递，还需要运用一个载体平台，使其具有足够的免 疫原性去引导4E10样抗体进化。 由于粘膜是HIV感染的主要途径之一，因此粘膜免疫是预防HIV性传播的重要手 段。对于HIV表位疫苗来说，人们期望构建一种疫苗载体既能提高表位的免疫原性并能通 过粘膜途径有效地将HIV抗原表位递呈给机体的免疫系统，诱导产生局部粘膜的IgA和 CTLs的反应，以及全身的特异性CTLs及IgG、IgM的反应。减毒沙门菌就是这样一个理想 的高效递呈外源抗原的粘膜载体的候选者，这是因为沙门菌是具有高度侵袭性的细胞内寄 生菌，在感染人体后不仅可以刺激机体产生良好的局部粘膜免疫反应，而且由于其细胞内 寄生的特性，沙门菌能诱导机体形成较广泛的全身免疫反应，包括血清抗体、粘膜IgA抗体 以及不同类型的细胞介导免疫反应。携带外源抗原的沙门菌可直接接触肠道局部粘膜，并 由此侵入肠粘膜上皮细胞。开始，沙门菌可滞留在内噬小体内，但其质粒所携带的抗原可经 细胞凋亡机制释放出来，被抗原提呈细胞加工后，传递给免疫活性细胞，从而诱导体液及细 胞免疫反应一一这是迄今沙门菌用作疫苗载体在体内诱导免疫的一般过程，其中很多情况 下沙门菌是用来携带载有抗原表位的质粒载体。然而在使用质粒载体的过程中存在着一个 明显问题，即表达质粒在体内的不稳定性，这是因为重组质粒往往带有抗生素耐药基因，在 人体内缺乏抗生素压力的情况下，质粒易丢失。也有研究者把抗原表位基因整合到染色体 上，然而外源基因的表达通常水平低下，难以产生足够的重组蛋白以激发机体的免疫反应。 有研究表明将甲1型流感病毒HA上的抗原肽和NP上的抗原肽与沙门氏菌鞭毛蛋白融合表 达，经鼻免疫BALB/C小鼠后能够抵御不同亚型流感病毒（H1NUH2N2和H3N2)的攻击。但 由于鞭毛是细菌的动力器官而且数量较少，如何提高携带外源蛋白的数量以增强携带蛋白 的免疫原性是沙门菌疫苗载体急需解决的问题。 沙门氏菌细聚合菌毛（Thin aggregative fimbriae)和细菌的抗原性及黏附性有 关，直径3-4nm，为周身菌毛（500根/细胞），其单体蛋白（fimbrin)携带的外源表位拷贝 数可达500, 000/细胞，适宜作为活疫苗。该细聚合菌毛结构稳定，不溶于5M Na0H、8M尿素 或2%十二烷基磺酸钠（SDS)，其单体蛋白仅在90%甲酸溶液中发生解聚。AgfA蛋白是细 聚合菌毛的一种主要的单体蛋白，在沙门菌中结构保守。该蛋白抗原性强，对于检测插入其 中的外源表位是十分重要。 沙门氏菌细聚合菌毛agfA具有以下特点：1)高水平表达并且位于细菌的表面。沙 门氏菌的细聚合菌毛是细菌表面毛发状蛋白附属物，一般不参与细菌的运动而有可能与细 菌的黏附有关。细聚合菌毛的表达量非常高，每个细菌大约有100~1000条，每条细聚合 菌毛至少由1000个相同的菌毛亚单位呈螺旋状排列聚合而成。因此如果以细聚合菌毛为 载体表达外源多肽则其表达量将非常强大。2)很大的容纳性。外源片段的置换几乎不影响 agfA自身的表达3)可起到佐剂的作用。以此为载体表达的表位将能有效地刺激机体产生 强有力的免疫反应。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带外源蛋白HIV-4E10数量多的重组沙门氏菌，以 及提供该沙门氏菌在制备HIV-4E10表位疫苗中的应用。 本专利技术首先提供一种重组质粒，其为PHSG-4E10,通过以下方法构建得到： (1)两步重叠 PCR法构建嵌合基因 agfA: :4E10 ; (2)将嵌合基因 agfA: :4E10片段与温度敏感性质粒HSG415通过酶切连接得到。 其中，步骤（1)所述的两步重叠 PCR方法为： 1)第一轮 PCR 扩增：分别以 agfAfor 和 4E10rev，4E10for 和 agfArev 为引物，以 沙门氏菌基因组为模板PCR扩增得到两个目的片段A和B ; 所述agfAfor引物序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述agfArev引物序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述4E10for引物序列如SEQ ID NO. 3所示； 所述4E10rev引物序列如SEQ ID NO. 4所示； 2)第二轮PCR扩增：以A和B为模板，agfAfor和agfArev为引物进行PCR扩增得 到含有外源基因4E10的嵌合agfA片段agfA: :4E10。 本专利技术提供了上述重组质粒在制备预防或治疗HIV引起的疾病药物中的应用。优 选地，所述的药物为疫苗。 本专利技术提供了沙门氏菌细聚合菌毛agfA的A6氨基酸在制备重组沙门氏菌中的用 途，专利技术人进一步发现，将此区域替换掉后不影响该菌毛的生物学活性。 本专利技术提供了沙门氏菌细聚合菌毛agfA的A6氨基酸在制备以agfA为载体的外 源基因表达载体中的应用，是将外源基因置换沙门氏菌细聚合菌毛agfA的A6氨基酸的序 列 STIELTQNGFRNNATT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组质粒，其为pHSG‑4E10，通过以下方法构建得到：(1)两步重叠PCR法构建嵌合基因agfA::4E10；(2)将嵌合基因agfA::4E10片段与温度敏感性质粒HSG415通过酶切连接得到。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘树林，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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