一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法技术

技术编号:12834669 阅读:128 留言:0更新日期:2016-02-07 20:14
本发明专利技术公开了一种制备森林脑炎灭活疫苗的生产方法,提供一种森林脑炎病毒SZV株,病毒滴度可以达到并稳定在8.5lgLD50/ml,同时证明该株病毒生物学活性稳定,抗原性广、免疫原性良好、无外源因子污染;作为毒种用于制备森林脑炎灭活疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了,设及利用生物反应器、采 用Vero细胞制备森林脑炎灭活疫苗的方法,特别是工业化制备的方法,属于生物制药领 域。
技术介绍
森林脑炎又称婢传脑炎,是由森林脑炎病毒引起的,流行于北溫带的,W婢类为主 要传染源,W侵犯中枢神经系统为主的自然疫源性疾病,病死率在20%~30%,是一种严重 危害人民健康的病毒性传染病,我国政府将其列入法定的由生物因素引起的职业病之一; 用于预防森林脑炎的疫苗,先后经历了用鼠脑、鸡胚、鸡胚细胞、原代地鼠肾细胞等基 质进行制备,目前,我国使用的是原代地鼠肾细胞制备的森林脑炎灭活疫苗,国外使用的是 鸡胚细胞制备的森林脑炎灭活疫苗,重组基因工程疫苗、减毒活疫苗等正处于研究之中,但 目前尚无重大突破; 我国目前使用的是原代地鼠肾细胞制备的森林脑炎灭活疫苗,对于降低森林脑炎的发 病率确实起到了重要的作用,使森林脑炎的发病率得到了控制;但由于在疫苗生产中使用 动物的原代细胞培养,在培养过程中缺点主要有:(〇、所使用动物的饲养、繁殖、无菌操作 等的控制存在诸多不便,因而限制了生产规模;(2)、受制于动物的级别,细胞基质中携带 外源因子的风险要高于传代细胞及二倍体细胞;(3)、原代细胞不能像二倍体细胞或是传 代细胞那样经严格检验后再使用;(4)原代细胞批间差异的风险要高于传代细胞及二倍体 细胞;(5)原代地鼠肾细胞不适合使用生物反应器进行大规模高密度培养,因此急需一种 即对森林脑炎病毒敏感又可用于生物反应器培养的传代细胞基质来制备森林脑炎灭活疫 苗。
技术实现思路
本专利技术于提供,通过传代细胞系(Vero细 胞)培养而制备的疫苗,包含灭活的森林脑炎病毒,并且Vero细胞DNA残留量小于10化邑/ 剂,该疫苗具有功效,具有对可能与病毒接触的任何人进行免疫注射的安全性; 本专利技术所述的一种森林脑炎病毒,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中屯、,地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏号为=CGMCCNo. 10960,保藏日 期为2015年7月17日;命名为:森林脑炎病毒。 本专利技术所述森林脑炎病毒SZV株制备森林脑炎灭活疫苗生产方法,包括W下步 骤: 1)、细胞培养 Vero细胞使用含有新生牛血清的动物细胞培养液进行培养,生长液的抑值为6. 8~ 7. 6,培养溫度为36~38°C,在细胞培养瓶进行培养或采用片状载体进行生物反应器培养 时,细胞的接种浓度可选择为1.OXIO5~1.OX10 6; 所使用的动物细胞培养基,含有4~10%的新生牛血清的MEM或是199溶液,培养液的 抑值为6. 8~7. 6,培养溫度为36~38°C; 2) 、病毒接种 当Vero细胞在生物反应器中的片状载体上长成致密单层后,接种森林脑炎病毒SZV株,病毒感染复数可W选择为0.001~1.0之间,优选为0.001~0.5 ;病毒感染后选择抑 值为7. 6~8. 6的含有0. 1%~2%新生牛血清的MEM或是199溶液进行维持,培养溫度为 32 ~:M°C; 3) 、病毒收获 病毒在Vero细胞中增殖,病毒液细胞感染SZV株病毒并培养2~6天后,即可开始进 行流加收获,流加速度5~20L/24小时,可W连续收获10~30天,流加液为抑值7. 0~ 7. 8含有0. 1%~2%新生牛血清的MEM或是199溶液,培养溫度为32~34°C; 4) 、澄清处理 病毒收获液经过滤的方法进行澄清处理,W去除细胞碎片等杂质,取上清液待进一步 纯化;澄清工艺是选择0. 45~1. 0Jim滤柱进行; 5) 、超滤浓缩 经澄清处理后的病毒收获液可W选择100~500KD的超滤膜包进行超滤浓缩,浓缩倍 数可W选择20~60倍; 6) 、病毒灭活 浓缩后的病毒液选择P-丙内醋进行灭活; 7) 、柱层析纯化及除菌 灭活后的浓缩病毒收获液通过凝胶过滤排阻层析,凝胶过滤的洗脱线性速度为20~ 40cm/小时,操作溫度控制在4~25°C; 病毒浓缩液经柱层析纯化后立即进行除菌,采用0. 22ym的除菌滤膜或滤柱进行,除 菌后即为原液; 8) 、疫苗配制 将原液按照抗原含量为1:8~1:64进行稀释后用佐剂配制成药物的形式。 阳0化]本专利技术设及的Vero细胞是森林脑炎病毒的敏感细胞之一,适合于森林脑炎灭活 疫苗的生产,特别是选择森林脑炎病毒森"张"株的Vero细胞适应株(W下称SZV株)森林 脑炎病毒SZV株经过全面检定, 本专利技术的积极效果在于:提供一种森林脑炎病毒SZV株,病毒滴度可W达到并稳定在 8. 51gLDw/ml,同时证明该株病毒生物学活性稳定,抗原性广、免疫原性良好、无外源因子污 染;作为毒种用于制备森林脑炎灭活疫苗。本专利技术培养条件易标准化;基于建立的细胞库 进行生产,使生产的一致性和连续性好;营养要求不是很高,可用标准培养基,培养起来比 二倍体细胞、原代细胞更加容易;可用于微载体生物反应器进行大规模生产。【具体实施方式】 通过W下实施例进一步举例描述本专利技术,并不W任何方式限制本专利技术,在不背离 本专利技术的技术解决方案的前提下,对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。 阳〇〇7] 实施例I 取已经长成致密单层的Vero细胞,弃去细胞生长液,加入Versene溶液清洗,弃去, 加入抑值为7. 4终浓度为0. 1%的细胞消化液进行消化,待细胞出现圆缩、毛玻璃样改变 后,弃去细胞消化液,按照生长液实施案例1中的配方配制细胞生长液并分散细胞,在细胞 培养瓶进行细胞培养或采用片状载体进行生物反应器培养时,细胞的接种浓度可选择为 1.0XlOVml。培养溫度为36~38°C。使用片状载体进行生物反应器进行培养时,可采用 流加培养方式,培养48小时后,可长成致密单层细胞。 弃去生物反应器内的细胞生长液,用Earle'S液或0.Olmol/L憐酸盐缓冲液冲洗 细胞后弃去,加入含有森林脑炎病毒SZV株的维持液,病毒感染复数可W选择为0.OOl~ 1. 0之间,优选为0.OOl~0. 5 ;按照维持液实施案例1中的配方配制维持液,培养溫度为 32~34°C,经24小时培养后开始进行流加收获。 病毒收获液经0. 45 ym滤柱进行澄清,W去除细胞碎片等杂质,取上清液待进一 步纯化。 病毒收获液经澄清处理后,可W选择IOOKD的超滤膜包进行超滤浓缩,浓缩倍数 可W选择20倍。 浓缩后的病毒液选择1/2000的0 -丙内醋进行灭活,灭活时间为24小时灭活溫 度为2~8°C;在灭活过程中注意摇晃,使灭活剂能够与病毒液充分接触。灭活到期后,在 35~37°C水浴2~4小时,W使残留的P-丙内醋降解。浓缩病毒液经灭活后,选择Se地arose 4FF介质,用抑7.4~7. 8的0.OlMPBS缓 冲液平衡后,进行柱层析纯化,用紫外监测仪(A=280nm)检测洗脱液,收集洗脱的第一峰为 森林脑炎病毒抗原,检测蛋白质含量、抗原含量,根据蛋白质含量及抗原含量稀释到一定浓 度后进行除菌过滤,并加入终浓度为0. 1%的人血白蛋白为稳定剂。根据原液中的蛋白质含量及抗原含量,使用疫苗稀释剂进行稀释,本专利技术中使用 的是抑值为7. 4~7. 8的0.Olmol/L憐酸盐缓冲液。加入终浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种森林脑炎病毒,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏号为:CGMCC 10960,保藏日期为2015年7月17日;命名为:森林脑炎病毒SZV株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:孙宏亮刘岩松薛洪伟李文娟刘双军李丹王伟张伟红赵红丽刘梦妮尹兵
申请(专利权)人:长春生物制品研究所有限责任公司
类型:发明
国别省市:吉林;22

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