本发明专利技术公开了一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品，步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK-α-2，3Gal；步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装即可；本发明专利技术具有有效降低生产成本，成品疫苗质量高，满足规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗需求的特点，疫苗成品可以是单价苗、二价苗或三价苗，扩大疫苗的免疫范围，增强免疫效果，培养过程中不需更换培养基，有助于降低污染率，简化培养过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗制备
，具体而言涉及一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产 品。
技术介绍
禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类 传染病。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感爆发的主要措施，由于MDCK细胞对各种流感 病毒均较敏感，已广泛应用于流感病毒的感染、检测及培养等领域。 由于MDCK细胞具有须贴附而生长的特性，大多数厂家采用微载体细胞悬浮培养， 此工艺适用于难以驯化为全悬浮的细胞，其最大培养体积不超过300升，载体培养在成本、 细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷；少数厂家采用全悬浮细胞培 养，但是使用含有动物源血清成分的培养基，提高了外源污染几率，生产成本高，所得细胞 密度不高，难以达到高滴度，所接种毒仍为鸡胚毒，在培养过程中需要更换培养基，增加了 污染的几率，生产过程过于繁琐；病毒液需浓缩后使用，使得产量大大降低，所生产的疫苗 成品是单价苗，免疫范围过于单一，不能实现大规模工业化生产，无法满足规模化、工业化 生产优质禽流感灭活疫苗的需求。 普通MDCK细胞同时存在α -2, 3和α -2, 6唾液酸转移酶I，而禽流感病毒倾向识 别α -2, 3唾液酸转移酶I，提高MDCK细胞表面α -2, 3唾液酸转移酶I的受体丰度，可提高 禽流感病毒吸附细胞的几率，提高禽流感病毒的滴度。 专利CN 101613678Α公开了一种MDCK-ST3GAL I细胞系，采用此细胞系培养的禽 流感病毒，在病毒滴度和蚀斑大小方面均优于普通的MDCK细胞，但是，如何将此细胞系作 为种细胞培养禽流感病毒，进而获得禽流感疫苗，是一项值得技术人员深入研究和解决的 技术问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种禽流感灭活疫苗生产工艺及产品。 为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案： -种禽流感灭活疫苗生产工艺，包括以下步骤： 步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK-α -2， 3Gal，所述MDCK-α -2,3Gal的制备方法与专利CN 101613678Α公开的方法相同，本专利技术中 不再赘述； 步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原； 步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装 即可。 进一步，采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞的方法为： (1)将无血清培养基放置在36. 5-37. 5°C水中，加热30-40min ; (2)取种细胞冻存管，置于36. 5-37. 5°C的水中，并震荡使其完全融化，将细胞冻 存管中的悬液转移至细胞培养瓶； (3)取经步骤（1)处理的无血清培养基100-120ml，加入细胞培养瓶中，使初始细 胞密度为0. 5 X 106-1 X 106个/ml，并将细胞培养瓶转移至培养箱中培养； (4)当细胞培养瓶中的细胞存活率彡90%，且细胞密度为1 X 106-10X 106个/ml 时，将细胞培养瓶内的种细胞无菌移种到不同体积的细胞反应器中，进行逐级放大培养。 进一步，所述细胞反应器的体积为7-2000L，所述细胞反应器内初始细胞密度 0. 5 X 106-1 X 106个/ml，所述种细胞至少经过3种不同体积的细胞反应器传代培养，并且细 胞反应器的转速按照前者转速的10-20 %逐级降低。 进一步，所述种细胞在细胞反应器内的培养条件为： pH 值为 6. 95-7. 15,溶氧浓度为 45 % -55 %，温度为 36. 5-37 °C，转速为 60-90rmp， 压强为 100-200mbar〇 进一步，在培养过程中，向细胞反应器内通入无菌的1-1. 5N的NaHC03补料液，并 实时监测细胞反应器内葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加不 含钠离子的流加培养基，所述流加培养基为无血清培养基的8-10倍浓缩液。 在培养过程中，种细胞会消耗细胞反应器内培养基的营养成分，为了保障种细胞 的正常生长，当葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加高浓度的培养基，而培养基 中的钠离子会改变溶液的渗透压，因此，选择不含钠离子的流加培养基。 进一步，所述步骤二中，将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒的 方法为： (1)进行种毒接种时，细胞反应器中细胞存活率多90%，且细胞密度为 3X 106-15X 106个/ml，细胞种毒接种剂量为细胞反应器内培养基总体积的1% -10% ; (2)种毒接种后，将细胞反应器的温度设置为39-41°C，并将转速降低40-50%，维 持 2-4h ; (3)将细胞反应器的转速恢复至种毒接种时转速，每6_8h降低1_2°C ; (4)细胞种毒接种23-24h后，每隔2. 5-3. 5h采样检测病毒含量、细胞密度和细胞 活力，当病毒液血凝价> 2,细胞密度< 3X106个/ml，且细胞活力< 30%时，收获禽流感 病毒； (5)将禽流感病毒进行澄清、灭活处理，按照常规方式制备制苗抗原。 降低转速，有助于增加细胞种毒与种细胞的接触几率，从而提高细胞种毒吸附效 率，提高病毒滴度，同时，将细胞反应器的温度设置为39-41Γ，有助于促使种细胞表面与细 胞种毒结合的受体充分展开，并有效结合。 进一步，所述细胞种毒的病原类型为H5N1亚型或H9N1亚型。 进一步，所述细胞种毒的制备方法为： 将所述种细胞采用无血清培养基进行全悬浮传代培养，当细胞密度达到 9 X 106-10X 106个/ml时，接入禽流感病毒的病原，禽流感病毒接入剂量为细胞反应器内培 养基总体积的3% -4%，在35-36°C条件下，培养46-50h，经-70°C冻融后离心，血凝价> 1 : 21°时，收获细胞种毒，并将其保存在_70°C至_60°C的环境中，备用。 细胞种毒可以避免鸡胚的诸多缺陷，有效避免种间病毒传播，另外，鸡胚种毒成本 高、产能低、污染环境，而细胞种毒可大批量生产、清洁环保。 进一步，所述步骤三中，将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗的方法 为： 将所述制苗抗原使用磷酸盐缓冲液稀释为水相，将水相、矿物油佐剂按照1 :2_1 : 3混合乳化，所述制苗抗原为单价苗、二价苗或三价苗，所述单价苗的制苗抗原稀释4-20 倍，所述二价苗的制苗抗原稀释2-10倍，所述三价苗的制苗抗原稀释2-6倍。 另，本专利技术还提供了一种禽流感灭活疫苗产品，所述疫苗产品采用所述的生产工 艺制得。 所述疫苗产品可以为H5N1疫苗或H9N1疫苗，并且所述疫苗产品可以为单价苗、二 价苗或三价苗，有助于扩大疫苗的免疫范围，增强免疫效果，适用范围广，实用性强。 为了提高种细胞的密度，获得高滴度的禽流感病毒，专利技术人对种细胞的培养条件 进行如下优选： -、专利技术人选用NaHC03作为补料液，由于NaHCO 3呈现弱碱性，其通入细胞反应器 后，不会引起反应器内局部pH值迅速当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种禽流感灭活疫苗生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞，所述种细胞为MDCK‑α‑2，3Gal；步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；步骤三：将步骤二制备的制苗抗原，进行稀释乳化制备疫苗，检验合格后定量分装即可。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋桂才，王洪林，
申请(专利权)人：山东信得动物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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