本发明专利技术是一种苏氨酸脱氨酶活性包涵体的制备及其应用。本发明专利技术在于：成功得到了一株可以产苏氨酸脱氨酶活性包涵体的重组工程菌，苏氨酸脱氨酶活性包涵体易于分离及重复利用，性质稳定，在不同的使用环境及使用一段时间后依然可以保持较高的酶活，且可以积累101.6g/Lα-酮丁酸，有效的解除了产物α-酮丁酸的反馈抑制作用。为α-酮丁酸及α-氨基丁酸的制备过程中的问题提供了有效的技术解决方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及构建一株重组大肠杆菌产苏氨酸脱氨酶活性包涵体以解除产物酮丁酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制作用的方法。
技术介绍
苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase, TD)包括生物合成型苏氨酸脱氢酶及生物降解型苏氨酸脱氢酶，以5’-吡哆醛磷酸盐(PLP)为辅因子，催化苏氨酸生成α-酮丁酸及一个氨分子。在植物和细菌中生物合成的苏氨酸脱氨酶包含一个Ν端磷酸吡哆醛结合催化域和C端调控域，该酶在原核细胞及真核细胞中均可能与甘氨酸C-乙酰基转移酶结合成为复合物协同作用，将苏氨酸转化生成α-酮丁酸和氨，然后以α -酮丁酸为反应物合成异亮氨酸，此途径即为异亮氨酸合成的关键步骤。α -酮丁酸也可被某些L-氨基酸脱氢酶催化生成α -氨基丁酸，α -氨基丁酸作为一种重要的化工原料和医药中间体如抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦的合成前体，具有广阔的应用市场。因此，苏氨酸脱氨酶已被应用于α-氨基丁酸的制备过程中。实验室在对苏氨酸脱氨酶纯酶的研究中，发现苏氨酸脱氨酶不稳定，放置一段时间后酶活损失的很快，且苏氨酸脱氨酶会受产物α-酮丁酸的反馈抑制作用。在实际制备α -氨基丁酸的过程中，苏氨酸脱氨酶也是重要的一个限制因素。因此，利用基因工程手段对苏氨酸脱氨酶进行改造以改善该酶的稳定性及解除产物α-酮丁酸的反馈抑制作用是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的主要研究内容:本专利技术在于通过改造苏氨酸脱氨酶的C端调控域并将其连接到大肠杆菌(Escherichia Coli，简称E.coli)表达质粒pET_28a上，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-td/BL21。并成功得到了一株可以产苏氨酸脱氨酶活性包涵体的重组工程菌，苏氨酸脱氨酶活性包涵体易于分离及重复利用，性质稳定，在使用一段时间后依然可以保持较高的酶活，且可以积累大量的α -酮丁酸，有效的解除了产物α-酮丁酸的反馈抑制作用。为α-酮丁酸及α-氨基丁酸的制备过程中的问题提供了有效的技术解决方案。本专利技术的技术方案:1.苏氨酸脱氨酶引物的设计根据苏氨酸脱氨酶C端调控区域的氨基酸系列，设计一系列引物以改造苏氨酸脱氨酶的C端。Ρ1:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)P2:5， -CCCAAGCTTTTACCTGAACGCCGGGTTATT-3， (Hind III)P3:5， -CCCAAGCTTTTAGTTATTGGTTTCGTCG-3’ (Hind III)P4:5，-CCCAAGCTTTTAGTGGCAATCGTAGCC-3，(Hind III)P5:5， -CCCAAGCTTTTACAGCTCATTCAGCCGGGT-3， (Hind III)2.重组菌的构建以大肠杆菌染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用相同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接，将连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞，挑取阳性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40°C冰箱保存。2.重组大肠杆菌产苏氨酸脱氨酶活性包涵体利用LB培养基活化重组大肠杆菌，37°C、160r/min培养过夜后分别转接于100mlLB培养基中。接种量1 %，培养温度37 °C，摇床转速160r/min。培养至0D600约0.6?0.8时加入终浓度为ImM的IPTG，置于16°C摇床24h诱导表达。将获得的菌体用pH 7.5的50mMPB缓冲液洗涤两次，再加入pH 6.0-8.0的50mM PB缓冲液重悬，然后利用超声细胞破碎仪对重组大肠杆菌进行细胞破碎，离心取沉淀并利用pH 7.5的50mM PB缓冲液悬浮起来即得到所需的苏氨酸脱氨酶活性包涵体。3.苏氨酸脱氨酶活性包涵体转化L-苏氨酸制备α -酮丁酸将获得的活性包涵体用pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤两次，再加入pH 6.0-8.0的50mM PB缓冲液或pH 8.0-10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液重悬，然后于30_42°C不同温度下加入底物L-苏氨酸，通过加入一定浓度的氨水或氢氧化钠溶液控制pH在6.0-10.0之间，以HPLC检测底物α -酮丁酸的产率。本专利技术的有益效果:苏氨酸脱氨酶在催化苏氨酸生成α -酮丁酸过程中会受产物α -酮丁酸的反馈抑制作用。利用基因工程手段对苏氨酸脱氨酶C端氨基酸进行改造得到了一株可以制备苏氨酸脱氨酶活性包涵体的重组大肠杆菌。苏氨酸脱氨酶活性包涵体易于分离及重复利用，性质稳定，在使用一段时间后依然可以保持较高的酶活，且可以积累大量的α-酮丁酸，有效的解除了产物α-酮丁酸的反馈抑制作用。具有重要的工业价值。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做详细的说明，以下实施例不对本专利技术产生限制。实施例1:重组质粒pET-28a_td的构建及转化以大肠杆菌基因组DNA作为模板。根据大肠杆菌苏氨酸脱氨酶基因序列以及pET_28a质粒上的酶切位点设计td基因引物。根据该酶的C端调控区域适量减少部分氨基酸系列，分别设计了(P1/P2，P1/P3，P1/P4，P1/P5)四对引物:P1:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)P2:5， -CCCAAGCTTTTACCTGAACGCCGGGTTATT-3， (Hind III)P3:5， -CCCAAGCTTTTAGTTATTGGTTTCGTCG-3’ (Hind III)P4:5，-CCCAAGCTTTTAGTGGCAATCGTAGCC-3’ (Hind III)P5:5， -CCCAAGCTTTTACAGCTCATTCAGCCGGGT-3， (Hind III)利用染色体DNA作为模板，做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系:模板2 μ L，上下游引物各0.5 yL，dNTP Mix 4yL, lOXExTaq Buffer 5“1^，灭菌(1(1!120 37 μ L, Ex Taq DNA聚合酶1 μ L。PCR反应条件:94°C预变性，5min，一个循环；94°C变性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin 30s，30个循环;72°C，lOmin，一个循环;15°C，lOmin，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。构建重组质粒 pMDl8-T-tdl8/pMDl8-T-td30/pMDl8-T-td45/pMDl8_T-td60，导入感受态E.coliJM109o PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18_T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，pMD18-T 0.2 μ L，16°C过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化产物涂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苏氨酸脱氨酶活性包涵体的制备方法，其特征包括以下内容：1)根据苏氨酸脱氨酶C端调控区域的氨基酸系列分别减少6、10、15、20个氨基酸，总共设计4对引物以改造苏氨酸脱氨酶的C端。分别构建好4株重组大肠杆菌pET‑28a‑td18‑BL21/pET‑28a‑td30‑BL21/pET‑28a‑td45‑BL21/pET‑28a‑td60‑BL21。将重组菌利用超声波细胞破碎仪破碎后测定各个重组菌的酶活。2)将获得的活性包涵体用pH 7.5的50mM PB缓冲液洗涤两次，再加入pH6.0‑8.0的50mM PB缓冲液或pH 8.0‑10.0的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液重悬，然后于30‑42℃不同温度下加入底物L‑苏氨酸，通过加入一定浓度的氨水或氢氧化钠溶液控制pH在6.0‑10.0之间，以HPLC检测底物α‑酮丁酸的产率。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，周俊平，杨套伟，张蔡喆，戚云龙，郑俊贤，张显，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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