本发明专利技术公开一种特异性检测3型有蹄类博卡细小病毒的引物、探针及试剂盒。本发明专利技术的检测试剂盒及检测试剂具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的检测能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测技术，具体一种特异性检测3型有蹄类博卡细小病毒的引 物、探针和试剂盒。
技术介绍
博卡病毒（Bocavirus)隶属于细小病毒科细小病毒亚科的博卡病毒属。细小病 毒包括浓病毒亚科和细小病毒科亚科，前者主要感染昆虫，后者则主要感染脊椎动物。细小 病毒亚科又分为细小病毒属、博卡病毒属、红病毒属、依赖病毒属、貂阿留申病毒属等6个 属。猪博卡病毒（PorcineBocavirus,PBoV，又称猪博卡细小病毒）则是属于其中的博卡病 毒属，为单股线状无囊膜DNA病毒，基因组在5.2kb左右，包括3个开放阅读框（ORFs)，分 别为NS1，NP1和VP1/VP2。主要侵袭猪的呼吸系统和消化系统，在中国断奶仔猪多系统衰 竭综合征、猪高热病、仔猪腹泻等发病猪群PBoV的阳性率为30°/『100%。该病毒流行广泛，在 欧洲、美洲、中国、韩国、日本均有存在，流行病学调查研究发现，该病毒与猪群腹泻和呼吸 困难有一定的相关性。2013年国际病毒分类委员会（http: //www.ictvdh.org)对猪 博卡病毒的分型提出了新的建议，提出以NS1基因编码氨基酸同源性，将猪博卡病毒分为4 个种群：Ungulatebocaparvovirus2型（2型有蹄类博卡细小病毒，UBoV2包括PBoVl、 PBoV2、PBoV-A6 等毒株）、Ungulatebocaparvovirus3 型包括PBoV-SX株、Ungulate bocaparvovirus4型、Ungulatebocaparvovirus5型。其中的3型有蹄类动物博卡细小 病毒的代表毒株为PorcinebocavirusSX(GenBank登录号：HQ223038)，该基因型病毒在 我国湖北、上海、广东均有检出，该病的致病力情况还需要进一步研究，但感染广泛，尤其是 与腹泻、轮状病毒、圆环病毒的混合感染普遍。邓波、刘佩红等人在对上海市猪博卡病毒感 染情况调查时发现猪血清、猪粪便、猪鼻棉拭子和猪内脏进行检测，阳性率依次为24%、30%、 0%、67%。因此及时的诊断为该病进一步研究具有重要意义，也为猪病的诊断具有重要的参 考价值，及时避免猪群发病带来的经济损失。现有文献报道利用实时荧光定量PCR对猪博 卡病毒进行检测的技术(猪博卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立，邓波、刘佩红等 人，动物医学进展，2012,33 (9):70-74)，此方法可以对部分基因型的猪博卡病毒进行检测， 但不能区分是否为Ungulatebocaparvovirus3型的感染。与此同时，覃绍敏等（覃绍敏， 吴健敏，《猪博卡病毒全基因组序列分析与基因分型研究》.中国预防兽医学报，2014 36 (2))通过研究28条猪博卡病毒的全基因序列，发现猪博卡病毒普遍存在基因插入的现象， 并且变异率很高，全基因序列同源性在9. 3 %- 97. 5%之间，NS1基因同源性在22. 6%-53. 2% 之间，存在遗传多样性。因此，现有技术实质上无法精确诊断各个基因型的猪博卡病毒。不 同种群的猪博卡病毒在感染的组织、致病机理和宿主的选择上可能存在较大的差异，诊断 准确性十分必要，也会影响动物疫病的防治工作。Ungulatebocaparvovirus3型的代表毒 株HQ223038全长4677bp，包括4个完整的阅读框架非结构蛋白NS1、NP1，结构蛋白VP1和 VP2。因此为了达到特异性检测猪博卡病毒Ungulatebocaparvovirus3型的目的，本研究 针对NS1基因序列和编码氨基酸序列进行了大量的数据比对。根据NS1基因的保守区域设 计了引物和探针序列。为准确、高效地对3型有蹄类博卡细小病毒进行检测，尽早地完成病 疫的诊断和防治提供依据。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术公开一种能准确、快速检测3型有蹄类博卡细小病毒的引物对。 本专利技术的另一目的是提供一种与上述引物对配合使用的荧光探针。 本专利技术的第三个目的是提供检测3型有蹄类博卡细小病毒的检测试剂、试剂盒及 其反应体系。 本专利技术的第一个目的通过以下技术方案实现：一种用于检测3型有蹄类博卡细小 病毒的PCR引物对，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID N0. 2所示。 本专利技术的第二个目的通过以下技术方案实现：一种与上述引物对配合使用的荧 光探针，其序列为PboVPl如EQ ID N0. 3所示；所述探针的Y端标记有荧光报告基团， 3'端标记有不发光的荧光淬灭基团。 所述荧光报告基团为选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、R0X或CY5中的 任意一种；淬灭集团采用Biosearch Technologies公司的黑洞淬灭基团BHQ1,对于双标 探针、分子信标和FRET探针非常有效，对绿色至黑色发射光谱中的所有染料都有极好的光 谱重叠效应。 本专利技术通过NCBI数据库中获得与3型有蹄类博卡细小病毒所有同源基因序 列，并采用MegAlign软件筛选出NS1基因中一段位于3型有蹄类博卡细小病毒全序列 (GeneBank number: HQ223038.ll)的1538至1671位的高度保守序列（如SEQ ID N0.4 所示)，并以之作为模板，用primer Express5. 0软件，设计出引物及探针。 本专利技术所述检测Ub〇V3的引物对，以Ub〇V3的NS1基因为基础，采用本领域熟知 的引物设计软件设计引物，通过大量的序列分析、比对和多次试验，获得了能够检测Ub〇V3 型特异性强的检测引物和探针。正如本领域技术人员所掌握的，NS1基因在猪博卡病毒 的多个基因型中同源性较低，在22. 6-53. 2%之间，尽管Ub〇V3型内的序列同源性较高，在 98. 2-98. 6%之间；但是由于存在多个点突变，设计出敏感性高、特异性强的诊断引物和探 针十分困难。专利技术人通过MegAlign软件筛选出Ub〇V3的NS1基因中高度保守且特有的片 段后，进行了反复的论证和筛选，最终确定出一段具有134个碱基对的序列（如在如SEQ ID NO. 4所示)。这一片段在3型有蹄类博卡细小病毒中具有极高的保守度(在所有同源基因组 中均能找到100%同源的片段)，能够精确地将3型有蹄类博卡细小病毒区别于其他猪博卡 病毒。更需强调的是，专利技术人发现这一片段并无猪博卡病毒中普遍存在基因插入的现象，同 时在特定的反应体系中，具有极高稳定性，经多轮扩增仍能保持序列的一致而极少的突变， 对于提高诊断结果的精确度和诊断效率有非常重要的意义。这一效果与现有技术中，无法 特异性扩增猪博卡病毒以进行诊断的问题存在明显进步，尚未见有任何文献的报道，也未 见文献提及该段基因的保守性。 在确定需特异性扩增的目标片段之后，专利技术人在各种生物信息软件评估的基础上 进行长时间的筛选。现有技术由于无法确定诊断过程的靶序列，往往会设计一些简并引物 以增强应用的广泛性，但简并度过高的引物会对扩增的特异性带来影响。此外，经过专利技术人 对本专利技术针对的靶序列进行研究后，发现特异性引物中t或C的含量过高，极易导致靶序列 稳定性下降。因此，本专利技术中特异性引物的t或C含量受到严格控制，以降低其对靶序列稳 定性的影本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性检测3型有蹄类博卡细小病毒的引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物PboVF1 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 所示，下游引物 PBoVR1 的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周宇，唐连飞，徐鹏，宋斯伟，朱事康，于飞，吕飞，佟铁铸，李春萍，刘星，刘中勇，
申请(专利权)人：中华人民共和国惠州出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。