本发明专利技术公开了一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV） RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品RNA模板进行扩增，可检测到纯病毒RNA的pg级，其鉴定采用加入SYBR Green I ESE-Quant-tube Scanner仪器检测或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检样品是否含有传染性造血器官坏死病毒RNA。本发明专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一 种传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
传染性造血器官坏死病（Infectioushaematopoieticnecrosis，IHN)是0ΙΕ规定 需要通告的3种弹状病毒（rhabdovirus)性疾病之一。IHN最初流行于北美西部地区，主要 存在于溯河产卵的鲑鱼群中。上世纪70年代，传染性造血器官坏死病毒（IHNV)感染成为了 美国人工养殖的虹鳟鱼（Oncorhynchusmykiss)的重要病原。接着IHN随着污染了病毒的 鱼卵传到了西欧以及东亚的不少国家。虹鳟在这些国家是一种引进品种，IHN对虹鳟养殖造 成了严重的经济损失。同弹状病毒（Rhabdoviridae)科粒弹状病毒（Novirhabdovirus)属 的其他成员相似的是，IHNV为单负股RNA病毒，病毒基因组由11 000个核苷酸组成，编码6 个蛋白，病毒粒子呈子弹状。遗传进化分析显示，北美地区分离到的IHNV毒株的基因变异 程度较低。而在欧洲、日本以及韩国的虹鳟中分离到的IHNV毒株的差异却较大，这显示出 病毒在引入上述几个地区之后是各自独立遗传进化的。IHNV出现的基因变化被认为同宿 主特异性和毒力的改变有关。传染性造血器官坏死病（IHNV)最初在造血组织内增殖，其后 侵袭到其他内脏器官。经解剖可观察到，鱼的鳃丝褪色呈苍白色，显著贫血，肝、脾、肾也褪 色，贫血。病鱼初期呈昏睡状，游动迟缓，有时沉底；随水流漂浮在水面上的病鱼体色发黑， 眼球突出，腹部膨大，鳍基充血，不透明，粘液状管型粪便悬挂于肛门，体侧肌肉组织如背鳍 区和一些鳍基部的骨胳肌中有"V"形出血斑块的症状。培养分离传染性造血器官坏死病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期 太长，不适应口岸快速检测和大通关的时代要求。 因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法 成为目前急需解决的问题。利用恒温扩增技术原理研究开发的IHNV检测方法与检测试剂盒能快速、准确地 检测传染性造血器官坏死病（IHNV)，便于在基层水产养殖站受实验条件限制，无法承受昂 贵的仪器费用环境下，为鱼类的传染性造血器官坏死病进行诊断、确诊提供依据，以便及时 采取相应措施，防止大面积传播。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测引物 组。本专利技术的另一个目的在于提供一种传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测试 剂盒。本专利技术的另一个目的在于提供传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测方法。 本专利技术所采用的技术方案如下： 一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对 内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示： 一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的RT-LAMP检测试剂盒，其包括权利要求1 所述的检测引物组。一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：（1) 权利要求1所述的引物组；（2)逆转录酶；（3)DNA聚合酶；（4)RT-LAMP反应液；（5)阳性 对照和阴性对照。 上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1 :8 :4。 上述检测试剂盒，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶；所述逆转录酶为峨转录 酶。 上述检测试剂盒，所述RT-LAMP反应液含有：10mMdNTP、10XThermoPol反应缓冲 液、150mMMgS04水溶液，三者的体积比是8 :5 :2。 上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有传染性造血器官坏死病毒（IHNV)囊膜糖蛋 白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。 本专利技术的检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBRGreen 1〇 利用上述的试剂盒检测传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的方法，包括如下步骤 (1) 待检样品RNA的提取：采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA; (2) 恒温基因扩增反应：25μ1反应体系含有：IHNV-F3 0. 2μΜ，ΙΗΝν-Β3 0. 2μΜ， IHNV-FIP1·6μΜ，IHNV-BIP1·6μΜ，IHNV-LF0·8μΜ，IHNV-LB0·8μΜ，RT-LAMP反应液 12. 5μ1，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNAl~100ng，用DEPC水补齐到25μ1 ;设置阳 性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混勾后离心，并于63~65°C反应60~90min，并在 8〇°C持续 2min; (3) 结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。 在试剂盒中含有显色剂的情况下，往反应管中加入10XSYBRGreenI0.5μ1，然 后将反应管中置于ESE-QuantTubeScanner中，根据仪器所实时读取的荧光信号来判断扩 增结果。 本专利技术具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等 有益效果： (1) 快速高效：整个扩增只用60~90min即可完成，扩增产量可达109~10w个拷贝； (2) 操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性 等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和； (3) 高特异性： 本专利技术根据传染性造血器官坏死病毒（IHNV)的囊膜糖蛋白基因（g# 6基因，GenBank登录号为DQ164100. 1)设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区 域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定， 形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行； (4) 高灵敏度：最低检测极限可达到3. 6ng/反应； (5) 鉴定简便：可通过观察加入SYBRGreenI颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来 判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。【附图说明】 图1-3是实施例4的检测结果，图1:(1、2:无RNase水对照；3、4:IHNVRNA;5、 6:SVCVRNA;7、8:VHSVRNA);图 2:(1、2:IHNVRNA;3、4:HRVRNA;5、6:PFRVRNA;7、8: 无RNase水对照）；图 3 : (1、2 :无RNase水对照；3、4:IHNVRNA;5、6:IPNVRNA) 图4是实施例5的检测结果图（IHNVRNA，1 :10°倍稀释；2 :10 1倍稀释；3 :10 2倍稀释； 4 :103倍稀释；5 :10 4倍稀释；6 :10 5倍稀释；7 :10 6倍稀释；8 :DEPC水对照)。【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。 上述实施例为本专利技术较佳的实施方式，但本专利技术的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。 实施例1传染性造血器官坏死病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立 传染性造血器官坏死病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的RT‑LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：IHNV‑F3：CTATCTAGACGAACTGGTGAAG（SEQ ID NO:1）；IHNV‑B3：GTGAAGTTGGTAGCGTGAT（SEQ ID NO:2）；IHNV‑FIP：ATGCGGAGATCGGAACTTGGGCACGCCGAGATAATATCAA（SEQ ID NO:3）；IHNV‑BIP：TCTACGCTATGCACAAAGGCTCTCCTGTCCTTGGATACCTC（SEQ ID NO:4）；IHNV‑LF：ATAGGAGGTATGGAGTCACACT（SEQ ID NO:5）；IHNV‑LB：CATGACGGTCGTTGTGGA（SEQ ID NO:6）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈进会，陈珍容，黄伟，颜其贵，邱杨，刘建丽，赵丽，
申请(专利权)人：东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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