本发明专利技术公开了一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒及其表达方法，该重组质粒通过将人乳头瘤病毒16亚型L1基因和SUMO标签基因插入表达质粒中构建而成。本发明专利技术对HPV16 L1基因进行优化，使其更适合在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白，同时，本发明专利技术首次应用Sumo标签表达系统在大肠杆菌中融合表达，更进一步增加了目的蛋白的可溶性，使表达的目的蛋白具有更高活性。本发明专利技术的方法显著提高了目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到70μg/ml，这一数值明显高于本发明专利技术目的蛋白在其他原核表达系统中的产量，从而满足工业化生产的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型Ll蛋白的重组质粒、构建方法、 重组工程菌及其表达方法，属于基因工程
技术介绍
人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有 严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。 1977 年Lave;rty(Lave;rty,C.R. ,Russell,P.etal. 1977)在电镜中观察到宫颈癌组织中存 在HPV颗粒，1981 年，ZurHausen(HZiirHausen,etal. 1981)提出HPV可能与宫颈癌发病 有关的假设。此后，运一观点被越来越多的实验所证实。宫颈癌发病与人乳头瘤病毒化uman papillomavirusJPV)感染有直接关系，采用灵敏的检测方法，可W从几乎100%的宫颈癌 患者病变组织中检测到高危HPV-DNA。 根据核酸序列同源性，目前发现的HPV约有200多种基因型，其中与人类生殖道感 染有关的有40多种，依致病性不同，可分为高危型和低危型两类，HPV感染者发展为子宫颈 癌的几率约0. 2%。其中宫颈癌患者中，约50~60%是由HPV-16感染引起（^dboomers J.M.etal.，1999)，在世界范围内，HPV-16是与宫颈癌联系最紧密的基因型，并随地域变化 很小值oorbar，J. ,2005)。另外册￥18、33、45、52和58与宫颈癌的发生高度相关。全球每 年有约50万妇女患宫颈癌化OUtskyLA.etal.，1988)，其中约27万因宫颈癌死亡（80% W上在发展中国家），宫颈癌发病率仅次于乳腺癌。 因此，开发一种价格适宜、保护性良好的宫颈癌疫苗，特别是针对HPV-16的疫苗， 对于降低妇女宫颈癌发病和死亡率意义重大。HPV基因组长约8化，分子量约为5XIO6道尔顿，直径为50~60皿，正二十面体结 构。核屯、为单拷贝的基因组DNA，病毒衣壳由主要衣壳蛋白化1)和次要衣壳蛋白化2)组 成。其中，Ll蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，为主要衣壳蛋白，是高度保守的 糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依据，同时体外表达的HPVLl蛋白可自组装 成病毒样颗粒（virus-Ukeparticle,VLP) (Kirnbauer,R.etal. , 1992)。L2 蛋白为次要 衣壳蛋白是高度可变核蛋白，反映HPV抗原的多态性（Wang,J.W.，Roden,R.B.，2013)。而且 在病毒壳粒中大多数L2蛋白在Ll蛋白内部，因此，在开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白Ll 开发具有更好的针对性。 根据现有研究结果，Ll基因是一个好的免疫预防祀。在细菌中表达的Ll蛋白或 使用疫苗载体的Ll蛋白用于免疫，可保护动物不受病毒感染。在酵母细胞及杆状病毒表达 系统中表达HPVLl基因组装成病毒样颗粒（VLP)，该病毒样颗粒已经用于诱导与保护免受 病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。再者，VLP在形态学上与HPV毒粒完全相同，但 不含有潜在的病毒致癌基因，因此能诱导抗体应答而无感染或致癌危险性，在一定程度上， 能够替代天然病毒，经免疫后可诱导产生型别特异性中和抗体，有效保护机体免受同型病 毒的感染或再感染，因此VLP是HPV疫苗试验中最好的免疫原候选者之一。 最早关于HPV衣壳蛋白装配成VLP的研究是20世纪90年代用痘苗病毒表达系 统表达的HPV16Ll和L2蛋白狂houJ.et曰1.，1991)。Rose等用杆状病毒表达系统成 功表达了HPVLl蛋白并自组装成VLP(RoseR.C.et曰1.，1993)，专利W09420137(Rose R.C.etal.)公开了杆状病毒表达系统制备LI蛋白及VLP。化fmann在酿酒酵母中表达了 HPV6aLlW及L1+L2蛋白，并观察到了自组装成的VLPOtofmannK.J.etal.，1995)，专利 W09531532〇tofmannK.J.etal.)公开了由酵母表达系统制备重组VLP化LL1+L2)的方法。 专利US5888516(Kat虹inU.Jansen，etal.)也在酿酒酵母中表达了HPV16Ll和L1+L2 并观察到了自组装成的VLP。目前，有多家国外公司的HPV疫苗进入临床实验阶段，其中包括DNA疫苗W及治疗 性宫颈癌疫苗。其中由葛兰素史克（GlaxoSmithKline,GSK)公司开发的有HPV16、18病 毒衣壳蛋白Ll在昆虫细胞中自行组装成的二价VLPs疫苗（商品名CcrvarixK嫂苗）及默克 (Merck)公司开发的是HPV6、11、16、18病毒衣壳蛋白Ll在酵母菌中组装而成的四价VLPs 疫苗（商品名化地1川8=^苗）均已在国外上市。2014年12月10日，FDA官网宣布：Merck 公司研发的Gardasi!" 9巧价重组HPV疫苗）获批。 但是目前尚无利用Sumo标签大肠杆菌系统中用于促进HPV16Ll表达及用于制 备宫颈癌疫苗的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型Ll蛋白 的重组质粒、构建方法、重组工程菌及其表达方法，W提高HPV16Ll蛋白的可溶性、活性及 表达量。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种表达可溶性人乳头瘤病毒 16亚型Ll蛋白的重组质粒，将人乳头瘤病毒16亚型Ll基因和Sumo-tag标签基因插入表 达载体中构建而成。 所述重组质粒中Sumo-tag标签基因3'末端与人乳头瘤病毒16亚型Ll基因5' 末端连接。 所述重组质粒包括如SEQIDNO. 7所示的核巧酸序列。 所述Sumo-tag标签基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。 所述人乳头瘤病毒16亚型Ll基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示。 本专利技术所采用的技术方案还在于提供一种表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型Ll蛋 白的重组质粒的构建方法，包括W下步骤： (1)将Sumo标签基因上游5'端引入限制性内切酶化OI酶切位点和6*化s-tag 基因，在下游3'端引入限制性内切酶BsaI酶切位点，得到Sumo-tag标签基因； (2)将Sumo-tag标签基因和祀T-28a质粒分别用限制性内切酶化OI和BamHI 双酶切，二者的酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒I;重组质粒I转化大 肠杆菌感受态细胞JM109,涂布在KanaYLB固体培养基中培养，挑取单克隆接种于KanaYLB 液体培养基中培养，并进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行测序，测 序结果正确的，命名为重组质粒祀T28-Sumo ; (3)设计合成人乳头瘤病毒16亚型LI基因，装入PUC57质粒中，根据基因序列设 计合成正向引物H-F、反向引物H-R，进行PCR扩增，PCR扩增产物用限制性内切核酸酶Bsa I和化OI双酶切消化，备用； (4)重组质粒祀T28-Sumo用限制性内切核酸酶BsaI和化OI双酶切消化，备用；[002。 妨将步骤做和（4)的双酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒II; 重组质粒II转化大肠杆菌感受态细胞JM109,涂布在K本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒，其特征在于，将人乳头瘤病毒16亚型L1基因和Sumo‑tag标签基因插入表达载体中构建而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王爱萍，张改平，陈玉梅，王娟，刘运超，周景明，祁艳华，刘东民，刘燕凯，刘文英，栗宁，蒋敏，
申请(专利权)人：郑州大学，河南宏泽实业有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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