一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种双特异性抗体活化的T细胞及制备方法与应用，包括如下步骤：S1、取外周血进行离心，分离细胞和血浆，然后灭活血浆中的补体，收集细胞和血浆，备用；S2、将获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，洗涤，备用；S3、将获得的单个核细胞加入无血清培养液中，加入双特异性抗体、靶细胞、细胞因子和血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养的细胞，采用生理盐水离心洗涤，获得所述的双特异性抗体活化的T细胞；所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，双特异性抗体与T细胞表面抗原的解离系数大于1×10-7，与靶细胞表面抗原的解离系数小于1×10-9；双特异性抗体分子量为小于50KD；通过上述方法制备得到双特异性抗体活化的T细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞免疫学
，具体设及一种双特异性抗体活化的T细胞及制 备方法与应用。
技术介绍
肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者 体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、CD3AK细胞、TIL 细胞、CTL细胞、NK细胞和CIK细胞的免疫治疗。过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个 新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及细胞因子和分子祀向治疗广泛联合，成为肿瘤 综合治理的一个组成部分，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。 阳00引其中，T-细胞（即T淋己细胞）输入（trans化Sion)，称为过继T-细胞疗法，已 经过测试用于癌症和慢性感染的治疗。过继T-细胞疗法具有增强抗肿瘤免疫，提高疫苗 效力W及限制移植物抗宿主疾病的潜力。过继T-细胞疗法用作细胞源，尤其是，细胞毒性 T-细胞（CTLs),或肿瘤浸润淋己细胞（TILs)。在现有技术中常采用双特异性抗体"武装 (arm)"(活化的）T-细胞W形成它们和肿瘤细胞表面抗原之间的桥梁，W增强T-细胞的杀 瘤效应。双特异性抗体化ispecificantibody,BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，使功能分子（细胞）集中在祀细 胞周围，进而对祀细胞进行杀伤，产生祀向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿 瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免 疫治疗应用研究的热点之一，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细 胞上的祀分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。 如中国专利文献CN104630146A中公开的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞制备方法 及其应用，包括如下步骤：（1)获取外周血单个核细胞；（2)将获取的外周血单个核细胞与 基因修饰肿瘤细胞混合；（3)将获取的混合细胞重悬于含有能够维持细胞生长、增殖和分 化的细胞因子的培养基中。通过上述所制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞，主要在预防 或治疗癌症的药物中的应用，其优点在于制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞具有数量 多、特异性高和杀伤能力强等特性，此外，该制备方法还具有工艺简单而且成本较目前特异 性T细胞制备成本显著降低。然而，上述方案中通过双特异性抗体的连接，使肿瘤细胞对T 细胞进行抗原递呈，然后激活T细胞，再杀伤祀细胞，使得制备的肿瘤细胞特异性多克隆T 细胞具有特异性高的特点，由于其具有高特异性，则产生特异性杀伤效果，肿瘤细胞特异性 多克隆T细胞仅能杀伤祀细胞，而对于非祀细胞则没有杀伤作用。 阳0化]鉴于现有技术中还未提出一种方法制备具有扩增能力强、细胞活性强、细胞毒性 强和细胞数量多的具有非特异性杀伤效果的T细胞。为此，本专利技术提供了一种双特异性抗 体活化的T细胞及制备方法与应用。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供了一种双特异性抗体活化的T细胞及制 备方法与应用。 为此，本专利技术提供了一种双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，包括如下步骤：[000引 S1、取外周全血进行离心分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中 的补体，收集所述细胞和血浆，备用；S2、将所述步骤Sl中获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，然后洗涂，备 用； S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养 液中加入双特异性抗体、祀细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤Sl 中收集的血浆，随后按照常规方法进行解育培养，收集培养细胞，采用生理盐水离屯、洗涂， 获得所述的双特异性抗体活化的T细胞，即得； 其中，所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含至少一个祀向T细胞抗原表 位的结合位点和至少一个祀向祀细胞表面抗原表位的结合位点；所述双特异性抗体与所述 T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1X10 7,与所述祀细胞表面抗原表位的结合的解离 系数小于5X10 9;所述双特异性抗体分子量为小于50KD。 所述T细胞抗原为CD3和/或CD28。 所述祀细胞抗原为CD19、CD20和/或肿瘤、微生物的特异性抗原祀点。 优选的，所述T细胞抗原为CD3,所述祀细胞抗原为CD19。 所述祀细胞为灭活的B细胞、癌细胞或病原体细胞。 所述的方法，所述祀细胞为灭活的B细胞。 所述的方法，所述步骤S3中，所述单个核细胞的终浓度为化5-2)Xl〇6/ml，加 入的所述双特异性抗体的终浓度为0.Ing/na-lOOOng/ml，加入的所述祀细胞的终浓度为 (0. 001-50)Xl〇6/ml，加入的所述血浆的终浓度为0. 1% -10%。 阳01引所述的方法，所述步骤S3中，加入的所述细胞因子为IL-2和IFN- 丫，所述IL-2终 浓度为50-2000U/ml，所述IFN-丫的终浓度为50-3000U/ml。 所述的方法，所述步骤S3中，所述解育培养的步骤，培养条件为36-38°C，3-6% CA的二氧化碳培养箱中培养5-28天。 所述的方法，所述步骤S3中，所述解育培养的步骤中还包括补充培养液的步骤， 所述培养液包括所述IL-2、所述IFN-丫和所述步骤Sl中收集的灭活血浆。 所述的方法，所述步骤S3中，所述解育培养的步骤中还包括补充祀细胞的步骤， 每间隔4-10天适量补充祀细胞一次。 所述的方法，所述步骤Sl中，将分离的所述血浆置于56-6rC下水浴3-30分钟灭 活补体，优选的，于56°c水浴30分钟，于60°C水浴5分钟或于ere水浴3分钟。 本专利技术提供了一种由上述的方法制备得到的双特异性抗体活化的T细胞。 本专利技术还提供了一种所述的双特异性抗体活化的T细胞或其联合双特异性抗体 在制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物中的用途。在所述的用途中，所述的双特异性抗体活化的T细胞制备用于免疫治疗、预防或 治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包括如下步骤：将所述的双特异性抗 体活化的T细胞加入生理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。 在所述的用途中，所述的双特异性抗体活化的T细胞联合不同抗原祀点的双特异 性抗体制备用于免疫治疗、预防或治疗癌症或治疗微生物感染所致疾病的药物的方法，包 括如下步骤：取所述的双特异性抗体活化的T细胞进行洗涂，然后向其中加入适量的与T细 胞抗原具有高亲和力的特定祀标的双特异性抗体，解育培养，然后洗涂，收集细胞，加入生 理盐水中，并加入添加剂，制成细胞悬液，即得。 本专利技术技术方案相比现有技术，具有如下优点：[002引 1、本专利技术所述的双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，包括如下步骤：S1、取外 周血进行离屯、，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，备用；S2、将 所述步骤Sl中获得的细胞稀释成细胞悬液，分离出单个核细胞，收集单个核细胞洗涂，备 用；S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养液中 加入双特异性抗体、祀细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤Sl中 收集的血浆，随后按照常规方法进行解育培养，细胞数量能满足治疗的数量后，并且经流式 细胞仪检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性抗体活化的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取外周全血进行离心，分离所述外周血中的细胞和血浆，然后灭活所述血浆中的补体，收集所述细胞和血浆，备用；S2、将所述步骤S1中获得的细胞稀释成悬液，分离出单个核细胞，然后洗涤，备用；S3、将所述步骤S2中获得的单个核细胞加入无血清培养液中，向所述无血清培养液中加入双特异性抗体、靶细胞、能够维持细胞生长、增殖和分化的细胞因子和所述步骤S1中收集的血浆，随后按照常规方法进行孵育培养，收集培养细胞，采用生理盐水离心洗涤，即得所述的双特异性抗体活化的T细胞；其中，所述双特异性抗体具备活化T细胞的功能，包含至少一个靶向T细胞抗原表位的结合位点和至少一个靶向靶细胞表面抗原表位的结合位点；所述双特异性抗体与所述T细胞抗原表位的结合的解离系数大于1×10‑7，与所述靶细胞表面抗原表位的结合的解离系数小于5×10‑9；所述双特异性抗体分子量为小于50KD。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高岱清，朱化星，杨兆勇，高天一，孙伟红，朱丹妮，魏晓芳，郭庆明，汪康游，
申请(专利权)人：高岱清，高天一，
类型：发明
国别省市：山东;37