本发明专利技术提供癌症干细胞，所述癌症干细胞用于刺激针对癌症（如肝细胞癌（HCC））的免疫反应。本发明专利技术提供用于制备和纯化癌症干细胞的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】个性化的高纯度肝细胞癌干细胞、所述干细胞的方法和用 途 相关申请的夺叉参考 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2013年3月7日提交的美国临时专利申请 61/774,517的权益。本申请也是2013年8月6日提交的国际申请PCT/US2013/053850的 部分继续申请，所述国际申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2012年8月15日提交的美国 临时专利申请61/683, 477和2012年10月25日提交的美国临时专利申请61/718, 643的 权益。所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及肝细胞癌干细胞、源自所述干细胞的免疫原性组合物以及制造和使用 所述干细胞的方法。
技术介绍
在实体肿瘤中，较小百分比的细胞具有作为亲本肿瘤引发具有相同组织学异质性 的肿瘤的能力。这些细胞被称为癌症干细胞，并且也被称为肿瘤起始细胞或癌症起始细胞。 癌症干细胞可以由一组特性来定义。首先，其具有使自身再生的能力。第二，其在移植时能 够建立新肿瘤。第三，其可以被表征为休眠或缓慢循环(细胞周期)的肿瘤细胞。第四，其可 能是造成肿瘤对化学疗法或放射疗法的抵抗性的原因。第五，其取决于维持其再生并且产 生更分化祖细胞的能力的特定微环境，其中所述环境维持癌症干细胞的未分化状态。这种 微环境可以包括间充质细胞干细胞、组织相关联的成纤维细胞以及内皮细胞。在体外培养 的情况下形成球状体的能力是可以有助于将特定细胞识别为癌症干细胞的又一个特征。癌 症干细胞的一个非限制性定义是能够再生亲本肿瘤的完整异质性并且即使在多次传代之 后也连续地生长的细胞。 特定癌症干细胞群体可能是赘瘤来源，并且可能是已经治疗的癌症复发的来源。 另外，癌症干细胞在组织中的亚群当暴露于某些信号中时可能重新启动生长周期并且产生 可以重建肿瘤的细胞。癌症干细胞的小环境是休眠的，直到正确的信号传导触发再进入增 殖周期。再进入信号可以来源于局部事件，如外伤、细胞损伤、微生物攻击(病毒、细菌或真 菌)，或由局部生长因子、细胞因子或细胞间通信来介导。另外，激素可以调节组织特异性小 环境中的干细胞。干细胞小环境的缺陷或突变可能导致上文功能的扰动。赘瘤可能由这类 扰动产生，并且这些扰动包括影响对细胞周期的控制的随机突变。导致癌症的突变在个体 之间变化。在患有一种类型的癌症的那些人之间（如一个乳腺癌患者对比另一个乳腺癌患 者）以及在不同类型的癌症之间（如肝癌对比黑色素瘤）观察到这类变化性。 针对癌症发展出的疗法包括涉及自体免疫反应的方法。这些方法包括使用新鲜采 集的自体肿瘤细胞，所述自体肿瘤细胞解聚并调配成疫苗载体。另一种方法是树突状细胞 疫苗，其中树突状细胞用自体肿瘤裂解物脉冲。又一种方法是用半乳糖聚合物对患者的肿 瘤细胞进行体外修饰，并且将经修饰的肿瘤细胞注射回到所述患者中，其中半乳糖标记的 肿瘤细胞更容易由抗原呈递细胞（APC)吸收，由此增加抗肿瘤反应。这些涉及自体免疫疗法 的方法中的缺点是当使用块状肿瘤或块状肿瘤抗原作为免疫刺激剂时的低的抗原信噪比。 大部分肿瘤细胞是相当分化的并且与正常细胞如血管成分、结缔组织、分化的肿瘤细胞、非 活细胞和坏死细胞以及正常宿主组织混合。癌症干细胞仅代表肿瘤块的较小部分，在更具 攻击性的肿瘤中有时最多4%，最常见小于1%。因此，当使用块状肿瘤作为抗原来源时，免疫 反应是针对更分化的细胞，从而允许干细胞逃避攻击并且可能造成肿瘤的复发或转移。 另一种新疗法是针对在癌症中更丰富地表达的正常抗原的单一靶向抗体。特异性 抗原靶向疗法(如抗⑶133、抗EpCAM、抗⑶44、抗⑶13等）是无辨别力的，并且影响正常细 胞以及癌细胞，从而引起对患者的巨大不良作用。
技术实现思路
本文公开肝细胞癌（HCC)癌症干细胞（CSC)、HCC_CSC细胞系以及用于治疗肝细胞 癌的包含HCC-CSC负载型树突状细胞的免疫原性组合物。 特别地，本文提供一种用于制备肝细胞癌（HCC)癌症干细胞（CSC)的群体的方法， 所述方法包含：获取HCC样本；使所述样本的细胞解离，以及在非粘附性底物上在成分确定 的培养基中体外培养所述解离的细胞，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有 至少一种经由促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)路径起作用的生长因子，由此形成HCC-CSC球 状体；其中所述HCC-CSC球状体群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更 多个：α胎蛋白（AFP)、EpCAM、0vl以及0V6。在另一个实施方案中，所述HCC-CSC球状体群 体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：CK7、CK19以及E-钙粘 素。在另一个实施方案中，所述HCC-CSC球状体群体中至少约90%的细胞表达以下生物标 记中的两个或更多个：AFP、EpCAM、Ovl以及0V6。 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养 基中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基是无血清的并且补充有至少 一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成早期HCC-CSC的群体，其中所述早 期HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：Nanog、Sox2、 0ct3/4以及c-kit。在另一个实施方案中，所述早期HCC-CSC群体中至少约80%的细胞进一 步表达以下生物标记中的一个或多个：EpCAM、E-钙粘素、Sox 7、Sox 17、Fox2A、0vl、0V6、 ⑶133以及⑶90。在另一个实施方案中，所述早期HCC-CSC群体中至少约90%的细胞表达 以下生物标记中的两个或更多个：Nanog、Sox2、0ct3/4以及c-kit。 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培养基 中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清并且补充有至少一种经 由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成混合HCC-CSC的群体，其中所述混合HCC-CSC 群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：AFP、CK7、CK19、EpCAM、 E-钙粘素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。在另一个实施方案中，所述混合HCC-CSC群体 中至少约90%的细胞表达以下生物标记中的两个或更多个：六??、〇(7、〇(193?041^-钙粘 素、Nanog、FoxA2HNF4a以及ABCG2。 在另一个实施方案中，所述方法进一步包含在粘附性底物上在成分确定的培 养基中培养所述HCC-CSC球状体，其中所述成分确定的培养基含有血清来源并且补充 有至少一种经由所述MAPK路径起作用的生长因子，由此形成胚胎向间充质细胞转变的 (EMT)-HCC-CSC的群体，其中所述EMT-HCC-CSC群体中至少约80%的细胞表达以下生物标记 中的两个或更多个：NCAM、Slug/Snail以及Twist。在另一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC 群体中至少约80%的细胞进一步表达以下生物标记中的一个或多个：AFP、N-钙粘素、⑶44 以及波形蛋白。在又一个实施方案中，所述EMT-HCC-CSC群体中至少本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫原性组合物，其包含由源自经纯化的肝细胞癌(HCC)癌症干细胞(CSC)群体的肿瘤抗原离体活化的树突状细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：N贾布里尔，CT弗里德里克森，A科恩富思，
申请(专利权)人：新干细胞肿瘤学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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