一种高纯度莱菔素的制备方法技术

一种高纯度莱菔素的制备方法，属于莱菔素制备领域。本发明专利技术以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、酶膜反应、制备色谱、真空薄膜蒸发等生产得到高纯度莱菔素。本发明专利技术方法具有生产工艺连续、简单、稳定、提取纯化效率高、收率高、资源综合利用率高、无有害物质排放等特点。本发明专利技术在生产过程中，使用两种酶作为催化剂，大大提高了莱菔素的酶解产率。本发明专利技术提供生产莱菔素的方法纯化效率高，产品的纯度高达98％以上，且无溶剂残留。采用本发明专利技术方法生产出的产品，可广泛应用于医药、保健品等行业中。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度莱菔素的制备方法一、
本专利技术属于生产莱菔素的
，特别涉及一种高纯度莱菔素的制备方法。二、技术背景硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是十字花科植物重要的次生代谢物质，硫苷及其降解产物对植物的抗病虫害、特殊风味组成以及人类的健康具有重要作用。萝卜中同样含有硫苷，但萝卜中硫苷的种类与其他十字花科植物存在不同，萝卜中主要为4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷(俗称萝卜苷，glucoraphenin)。萝卜苷在萝卜籽中的含量最高，经黑芥子酶催化降解可生成4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯(俗称莱菔素，sulforaphene)。研究表明，莱菔素在抑制细胞突变及抗氧化等方面表现出极高的生物活性，具有极大的开发应用价值。萝卜籽粕是生产萝卜籽油的副产物，主要用作动物饲料，经济价值低。萝卜籽粕中含有的大量硫苷未得到有效开发利用，造成资源的极大浪费。现有生产莱菔素的方法，如2014年10月8日公开的公开号为CN104086467A“一种利用溶剂萃取法和分子蒸馏法联合制备莱菔素的方法”的专利技术专利，该专利公开的方法是：先将萝卜籽水解后，再用有机溶剂将莱菔素萃取并减压蒸馏得到莱菔素粗提物，最后利用分子蒸馏分离纯化技术得到高纯度的莱菔素产品。该方法存在的主要缺点有：①使用氯仿、二氯甲烷等有机试剂进行萃取，不但萃取选择性较低，而且使用过程中存在危险因素并污染环境。②分子蒸馏分离纯化技术所要求温度较高，需长时间受热，极易造成莱菔素降解，影响产品纯度。③所用设备昂贵，技术要求较高，生产能力有限，不便于工业化生产。④采用的原料综合利用率低，造成了萝卜籽中萝卜籽油、蛋白质等的极大浪费。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有生产莱菔素方法的不足之处，提供一种高纯度莱菔素的制备方法，该方法具有生产工艺连续、简单、稳定、提取纯化效率高、收率高、资源综合利用率高、无有害物质排放等特点。采用本专利技术方法制备出的莱菔素具有产品纯度高、性能稳定等特点。本专利技术的机理是：利用乙醇对萝卜籽粕中的硫苷进行提取，可得到硫苷提取物。硫苷在黑芥子酶的催化下可发生降解，其中，萝卜苷在黑芥子酶的催化下可生成莱菔素和葡萄糖，生成的葡萄糖会抑制萝卜苷的降解，而加入葡萄糖氧化酶，可以使葡萄糖转化为葡萄糖酸，降低葡萄糖对反应的抑制作用；酶膜反应器是膜和生物化学反应相结合的系统，依靠酶的专一性、催化性及膜特有的功能，可在生物反应过程中实现反应与分离的耦合，产物的原位分离、浓缩和酶的回收利用于一体，可以使酶重复使用以使反应体系维持较高的酶浓度，又可以把产物不断地从反应体系中分离出来以减少产物对反应体系的抑制作用，从而提高莱菔素的降解产率。制备色谱是一种简单而有效的制备数量较多的高纯品的方法，具有柱效高、分离速度快、产品纯度高、操作自动化等特点，是制备纯化天然产物和化学合成产物的极好手段。当溶于流动相中的各组分经过固定相时，与固定相发生吸附或分配作用，由于莱菔素与其它组分存在结构差异，这种作用的大小、强弱不同，各组分在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，使莱菔素得以分离。由于莱菔素在水中不稳定，极易降解。将制备色谱与吸附树脂层析柱耦联，基于固相萃取原理，使低浓度莱菔素从制备色谱流出后迅速吸附于树脂上，然后用少量无水乙醇将其洗脱下来，不仅提高其稳定性，而且达到快速浓缩的目的。本专利技术的目的是这样实现的：一种高纯度莱菔素的制备方法，以萝卜籽粕为原料，经过乙醇提取、酶膜反应、制备色谱、真空薄膜蒸发等生产得到高纯度莱菔素。其具体的方法步骤如下：(1)制备萝卜苷浓缩液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量(kg)∶体积分数为50～80％乙醇溶液的体积(L)之比为1∶6～9的比例，先在室温下搅拌反应4～7h，再用质量分数为2～6％的柠檬酸溶液调节pH至2～3，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为15000～20000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣。对于收集的沉渣，因含有丰富的蛋白质，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～10％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，即为萝卜苷浓缩液，用作下一步处理。对于收集的第二次反渗透透过液，与收集的第一次反渗透透过液合并，经减压蒸馏回收乙醇，经调配后得到体积分数为50～80％乙醇溶液，可继续使用。(2)制备低纯度莱菔素浓缩液第(1)步完成后，将第(1)步收集的第二次反渗透截留液，按照第二次反渗透截留液∶缓冲溶液的体积比为1∶8～12的比例，混合均匀得到原料液，备用。再按照第二次反渗透截留液的体积(L)∶黑芥子酶的质量(g)∶葡萄糖氧化酶的质量(g)为1∶1.5～3.0∶0.8～1.4的比例，先将黑芥子酶、葡萄糖氧化酶加入酶膜反应器的反应罐中，再将备用的原料液连续泵入反应罐中且不超过反应罐容积的2/3，在酶膜反应器的反应罐的温度25～30℃、搅拌速度30～60r/min，酶膜反应器中膜组件的截留分子量为200Da或300Da、压力为0.15～0.20MPa的条件下，进行连续水解反应和膜过滤，膜过滤过程中的截留液不断返回到反应罐中。连续反应和膜过滤结束后，分别收集透过液和反应剩余液。对于收集的反应剩余液，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。其中，缓冲溶液为pH7.1的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲溶液。对于收集的透过液，将透过液泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.09～0.095MPa、温度为20～30℃条件下，进行真空薄膜蒸发，直到溶液中莱菔素含量达55～65％时为止。收集浓缩液，即为低纯度莱菔素浓缩液，用作下一步处理。对于膜组件，经再生后可反复使用。(3)制备高纯度莱菔素第(2)步完成后，首先将市售已活化的吸附树脂(ADS-5树脂或H103树脂或HDP100树脂)分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，备用。将市售制备色谱填料(ProC1810μm色谱填料或ODS-AC1810μm色谱填料或ODS-AQC1810μm色谱填料)，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用。再按照制备色谱柱：第(2)步收集的浓缩液的体积比为1∶0.3～0.5的比例，将低纯度莱菔素浓缩液以流速为制备色谱柱体积的2～3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样。上样结束后，在检测波长为254nm，体积分数为25～35％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的2～4倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备。洗脱过程中，待流动相泵入15～16min时，将制备色谱流出端与吸附树脂层析柱连接，制备色谱流出液流入层析柱中，使制备色谱流出液中的莱菔素吸附于树脂上，待流动相泵入22～24min时，再将制备色谱流出端与吸附了莱菔素的吸附树脂层析柱断开，洗脱制备完成后，分别收集吸附了莱菔素的吸附树脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度莱菔素的制备方法，其特征在于具体方法步骤如下：(1)制备萝卜苷浓缩液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50～80％乙醇溶液的体积之比为1kg：6～9L的比例，先在室温下搅拌反应4～7h，再用质量分数为2～6％的柠檬酸溶液调节pH至2～3，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为15000～20000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣；对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～10％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，即为萝卜苷浓缩液，用作下一步处理；(2)制备低纯度莱菔素浓缩液第(1)步完成后，将第(1)步收集的第二次反渗透截留液，按照第二次反渗透截留液：缓冲溶液的体积比为1∶8～12的比例，混合均匀得到原料液，备用；再按照第二次反渗透截留液的体积：黑芥子酶的质量：葡萄糖氧化酶的质量为1L∶1.5～3.0g∶0.8～1.4g的比例，先将黑芥子酶、葡萄糖氧化酶加入酶膜反应器的反应罐中，再将备用的原料液连续泵入反应罐中且不超过反应罐容积的2/3，在酶膜反应器的反应罐的温度25～30℃、搅拌速度30～60r/min，酶膜反应器中膜组件的截留分子量为200Da或300Da、压力为0.15～0.20MPa的条件下，进行连续水解反应和膜过滤，膜过滤过程中的截留液不断返回到反应罐中；连续反应和膜过滤结束后，分别收集透过液和反应剩余液；其中，缓冲溶液为pH 7.1的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液或pH 7.4的三羟甲基氨基甲烷‑乙二胺四乙酸缓冲溶液；对于收集的透过液，将透过液泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.09～0.095MPa、温度为20～30℃条件下，进行真空薄膜蒸发，直到溶液中莱菔素含量达55～65％时为止；收集浓缩液，即为低纯度莱菔素浓缩液，用作下一步处理；(3)制备高纯度莱菔素第(2)步完成后，首先将市售已活化的吸附树脂，即ADS‑5树脂或H103树脂或HDP100树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，备用；将市售制备色谱填料，即Pro C1810μm色谱填料或ODS‑A C18 10μm色谱填料或ODS‑AQ C18 10μm色谱填料，分散于无水乙醇中，并装配成制备色谱柱，备用；再按照制备色谱柱：第(2)步收集的低纯度莱菔素浓缩液的体积比为1∶0.3～0.5的比例，将低纯度莱菔素浓缩液以流速为制备色谱柱体积的2～3倍/小时的速度，泵入制备色谱柱中，进行吸附上样；上样结束后，在检测波长为254nm，体积分数为25～35％的乙醇溶液为流动相，流动相流速为制备色谱柱体积的2～4倍/小时的条件下，将流动相泵入制备色谱柱中，进行洗脱制备；洗脱过程中，待流动相泵入15～16min时，将制备色谱流出端与吸附树脂层析柱连接，制备色谱流出液流入层析柱中，使制备色谱流出液中的莱菔素吸附于树脂上，待流动相泵入22～24min时，再将制备色谱流出端与吸附了莱菔素的吸附树脂层析柱断开，洗脱制备完成后，分别收集吸附了莱菔素的吸附树脂层析柱、吸附树脂层析柱流出液、制备色谱流出液和制备色谱柱；对于收集的吸附了莱菔素的吸附树脂层析柱，用与吸附了莱菔素的吸附树脂层析柱体积相等的无水乙醇进行洗脱，洗脱完成后，收集洗脱液；对于收集的洗脱液，泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.09～0.095MPa、温度为20～30℃条件下，进行真空薄膜蒸发，最后得到高纯度莱菔素；产品纯度达98.7～99.5％，总收率为89.3～92.6％。...

【技术特征摘要】
1.一种高纯度莱菔素的制备方法，其特征在于具体方法步骤如下：(1)制备萝卜苷浓缩液以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50～80％乙醇溶液的体积之比为1kg：6～9L的比例，先在室温下搅拌反应4～7h，再用质量分数为2～6％的柠檬酸溶液调节pH至2～3，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为15000～20000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣；对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15％为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～10％为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，即为萝卜苷浓缩液，用作下一步处理；(2)制备低纯度莱菔素浓缩液第(1)步完成后，将第(1)步收集的第二次反渗透截留液，按照第二次反渗透截留液：缓冲溶液的体积比为1∶8～12的比例，混合均匀得到原料液，备用；再按照第二次反渗透截留液的体积：黑芥子酶的质量：葡萄糖氧化酶的质量为1L∶1.5～3.0g∶0.8～1.4g的比例，先将黑芥子酶、葡萄糖氧化酶加入酶膜反应器的反应罐中，再将备用的原料液连续泵入反应罐中且不超过反应罐容积的2/3，在酶膜反应器的反应罐的温度25～30℃、搅拌速度30～60r/min，酶膜反应器中膜组件的截留分子量为200Da或300Da、压力为0.15～0.20MPa的条件下，进行连续水解反应和膜过滤，膜过滤过程中的截留液不断返回到反应罐中；连续反应和膜过滤结束后，分别收集透过液和反应剩余液；其中，缓冲溶液为pH7.1的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或pH7.4的三羟甲基氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，余春阳，王星敏，刘帆，邵承斌，
申请(专利权)人：重庆工商大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85