本发明专利技术涉及一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法及应用，包括以下步骤：第一步，将京尼平加入到无菌超纯水中，搅拌，超声振荡充分，放入25～40℃充分溶解，将0.2mL京尼平溶液加入含有2mL新鲜鸡蛋清的反应容器中，搅拌混匀；第二步，将加入交联剂京尼平的鸡蛋清放入恒温箱充分交联完全；第三步，将第二步得到的改性蛋清培养支架材料用移液枪逐滴滴入PBS溶液，保证能浸过材料但不溢出，静止12h以上，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重复若干次；第四步，反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌后，即得。本发明专利技术的材料硬度梯度容易控制，安全无毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备技术，特别涉及一种用京尼平(genipin)交联剂交联法制备得到的多个硬度梯度新型改性蛋清细胞培养支架材料的方法。
技术介绍
组织工程支架材料一般分为天然材料和人工合成材料。纯人工合成材料容易诱发炎症，韧性也难以保证。天然材料如胶原、壳聚糖、透明质酸等易于降解，且有一定的生物功能。根据不同的研究目的，可以将天然材料进行必要的化学修饰，改变优化其材料形貌和力学性质，用于组织工程需要。蛋白质作为天然高分子，具有良好的生物降解性和生物相容性，在生物医学及组织工程中有更广泛的应用前景。蛋清培养基含有细胞生长发育所需要的全部营养和信号成分，蛋清是一种以水作为介质，以蛋白作为分散相的胶体物质，约占鸡蛋总重的60%?63%。其中的85%?89%为水分，而剩余的固形物中，约有80%的蛋白质，20%的碳水化合物、脂质、无机成分和维生素等，其理化成分和力学性能及形貌有较大范围的可调节性，特别经济，易于获取。蛋白质具有大量的亲水基团，能在加热或溶剂的作用下发生凝胶化作用，形成具有三维结构的凝胶；同时其侧链含有大量的活性基团，包括氨基、羟基、巯基、酚基和羧基，可以被化学改性与交联，制备新结构的高分子材料。机体细胞外基质的材料形貌和力学性质在不同个体及同一个体的不同发育阶段有很大的差异，比如衰老、癌变等。这里通过对蛋清培养支架材料采用不同方式改性，制备不同硬度和形貌的材料用于研究细胞培养及对细胞增殖分化、蛋白表达、侵袭转移等行为的影响规律。蛋白质化学交联是一类重要化学修饰反应，所用交联剂为含有双功能基团的化学试剂。京尼平分子内隐含一个戊二醛的结构，能与氨基自发反应，生成物有荧光效应，便于实验观察。产物是深蓝绿色的。此外京尼平是从天然产物提取出来的，比戊二醛毒性小5000-10000倍。京尼平在水中溶解度不大，常温(25°C )下溶解度约为1%左右，随着温度的升高，溶解度增大。但京尼平在高温下稳定性不太好，因此建议在37°C左右的水中溶解京尼平，此时其溶解度为2%左右。如果要配制较高浓度的京尼平(大于4% )，可以先将溶液预热到50°C左右，再将京尼平加入，快速搅拌后溶解，这样可以缩短京尼平在高温下的时间。当然，如果可以的话加入少量乙醇或丙酮，可以显著提高京尼平在水中的溶解度。京尼平(genipin)用于蛋清细胞培养支架材料的交联改性，极其方便，且安全无毒副作用，所以是目前研究的热点，常用于生物医学高分子材料的交联改性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了提供，工艺简单，周期短，且适用于大规模生产。本专利技术的另一个目的在于提供一种新型改性蛋清细胞培养支架材料，交联度均匀，表面多皱褶或多孔，形貌结构统一。本专利技术提供的技术方案如下:一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的，包括以下步骤: 第一步，将京尼平加入到无菌超纯水中，搅拌，超声振荡充分，放入25?40°C充分溶解，将0.2mL京尼平溶液加入含有2mL新鲜鸡蛋清的反应容器中，搅拌混匀；第二步，将加入交联剂京尼平的鸡蛋清放入恒温箱充分交联完全；第三步，将第二步得到的改性蛋清培养支架材料用移液枪逐滴滴入PBS溶液，保证能浸过材料但不溢出，静止12h以上，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重复若干次；第四步，反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌后，即获得改性蛋清细胞培养支架材料。第一步中京尼平溶液的质量百分比浓度小于等于10%。第二步中交联时间不低于24h，恒温箱中温度为25_40°C。所述的紫外照射杀菌具体为超净台内紫外光照20_30min。第四步得到的改性蛋清细胞培养支架材料进一步制成改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末。基于所述的新型改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，将改性蛋清细胞培养支架移入六孔板中，向每孔加入0.4mL事先准备好的细胞悬液，细胞浓度为5X 104cells/mL,细胞数量每孔不低于104个；在培养过程中，小于等于7天的培养时间，采用连续追加培养液法进行培养；大于等于15天以上的培养期，则采用每3天各孔更新一半培养液的办法进行换液。所用的细胞悬液为正常动物及人体细胞或癌细胞中的贴壁细胞。所述的基于所述的新型改性蛋清细胞培养支架材料的细胞培养方法，所述的每天追加培养液法中每天追加量为0.5mL。所述的新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到的冻干粉末的应用，将所述的改性蛋清细胞培养支架材料冻干粉末添加到正在贴壁对数生长期的贴壁细胞培养瓶或皿里，短期培养后用以实现材料和细胞的分离。根据新型改性蛋清细胞培养支架材料的制备方法得到的冻干粉末的应用，每瓶T25卡氏瓶中添加的冻干粉末量小于等于0.05go有益效果:这种通过京尼平交联剂交联法制备得到的新型改性蛋清细胞培养支架材料，硬度梯度容易控制，所形成的皱褶和孔洞利于细胞的黏附生长。制备过程简单，材料经济，易于实现，蛋清本身可以给细胞提供一定的营养支持，不涉及采用高温高压装置，安全无毒副作用。【附图说明】图1是纯蛋清随时间变化及交联蛋清随京尼平溶液浓度变化的流变学剪切力特征。本专利技术新型改性蛋清细胞培养支架材料的流变学剪切力的变化特征，说明交联确实改变了培养支架材料蛋清的力学性质。图2是本专利技术实施例1、2、3、4、5、6获得的新型改性蛋清细胞培养支架材料的冻干扫描电镜SEM图像；各图显示了京尼平完全交联后的蛋清支架材料的形貌变化。(a)0.125%京尼平处理；(b)0.25%京尼平处理；(c)0.5%京尼平处理；(d)l%京尼平处理；(e)5%京尼平处理；(f) 10%京尼平处理。可见，本专利技术制备得到新型改性蛋清细胞培养支架材料表面皱褶、多孔，形貌结构统一。图3是采用本专利技术制备得到新型改性蛋清细胞培养支架材料培养卵巢癌SK0V3细胞的光学电镜结果，(a-f)卵巢癌SK0V3细胞在交联改性蛋清培养支架材料中聚集生长的情况。(a)0.125%京尼平处理的蛋清培养支架材料；(b)0.25%京尼平处理的蛋清培养支架材料；(c) 0.5 %京尼平处理的蛋清培养支架材料；(d) 1 %京尼平处理的蛋清培养支架材料；(e) 5%京尼平处理的蛋清培养支架材料；(f) 10%京尼平处理的蛋清培养支架材料(圆圈表明细胞已充满孔洞生长)。由图可见该材料结构利于细胞黏附生长。图4细胞在培养支架材料中的生长位点(用染料hocheSt2344将各浓度0.125%，ο.25% ,ο.5% , 1 %京尼平交联蛋清中生长的卵巢癌SK0V3细胞的细胞核染成蓝色)。图5不同浓度0.125%,0.25%,0.5%、1 %、5%的京尼品交联蛋清培养支架材料冻干粉对卵巢癌SK0V3细胞形态生长的影响。可以看出随交联程度的增加，细胞的形态更加不规则，长宽比增大，伪足变长当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型改性蛋清细胞培养支架材料的，其特征在于，包括以下步骤： 第一步，将京尼平加入到无菌超纯水中，搅拌，超声振荡充分，放入25~40℃充分溶解，将0.2 mL京尼平溶液加入含有2 mL新鲜鸡蛋清的反应容器中，搅拌混匀；第二步，将加入交联剂京尼平的鸡蛋清放入恒温箱充分交联完全；第三步，将第二步得到的改性蛋清培养支架材料用移液枪逐滴滴入PBS溶液，保证能浸过材料但不溢出，静止12 h以上，使其中的多余京尼平分子吸出去除，重复若干次；第四步，反应后，得到的改性蛋清细胞培养支架材料置于细胞超净工作台，紫外照射杀菌后，即获得改性蛋清细胞培养支架材料。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张天柱，郭振超，杨新明，房坤，田吉来，刘培党，顾宁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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