本发明专利技术公开了一种多标签抗原，该多标签抗原包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签，这9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的顺序依次串联。本发明专利技术还公开了该多标签抗原的制备方法及其在免疫印迹中的应用。本发明专利技术中公开的多标签抗原，可以满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求，具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及免疫印迹领域，尤其设及。
技术介绍
免疫印迹技术是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。对已知表 达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检 ，具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种 最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肤分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检 测等，因此免疫印迹技术在分子生物学研究中具有广泛的应用。 在设计表达一种蛋白时，通常都会进行融合蛋白表达，即在蛋白质序列的N端或 者C端加入常用的标签序列，如6地is、Flag、Myc等。在做免疫印迹检测目的蛋白表达量时 通常只需检测目的蛋白上加入的标签序列即可，即用6*化S、Flag、Myc等标签单抗与目的 蛋白抗原进行免疫印迹反应，检测出的信号强弱即反应出目的蛋白表达量的高低。在运用 质粒转染真核细胞表达目的蛋白，或者利用病毒侵染来表达某种目的蛋白时，往往会遇到 蛋白表达量很微量或者不表达的情况，此时采用免疫印迹技术检测目的蛋白的表达情况很 可能不会出现明显的信号。在运种情况下，需要判断到底是目的蛋白真实的表达量很微量， 还是免疫印迹检测的反应体系出现问题导致没有出现信号。因此在做免疫印迹检测时通常 都需要设置阴性对照和阳性对照，在出现上述情况时，若阳性对照工作正常出现明显的反 应信号，则说明待研究的目的蛋白表达量确定是微量表达或者不表达。 常用的标签有GST标签、HA标签、Str巧II标签、Flag标签、EGFP标签和His标签 等多种，在蛋白检测中，不同的目标蛋白根据其性质往往会选择不同的标签序列，现有技术 中多W单个标签作为阳性对照，运样当待测的多种蛋白质含有多个不同的标签序列时，贝U 需要多个相对应的阳性对照，即费时费力，也增加了检测成本。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术公开了一种多标签抗原，W满足大多数免疫印 迹反应设置阳性对照的需求。其技术方案如下： 本专利技术提供了一种多标签抗原，包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、 V5标签、Myc标签、Str巧II标签、Flag标签、EGFP标签和His标签。 优选地，该9种标签按照GST-HA-T7-V5-Myc-Str巧II-Flag-EGFP-His的顺序依次 串联。[000引优选地，9种标签的序列为SEQIDN0. 1所示的核巧酸序列。 本专利技术还提供了该多标签抗原的制备方法，包括W下步骤：(a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分别设置限 审IJ性内切酶位点，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体，测序，得到包含该沈QIDN0. 1序 列的质粒； 化）、将步骤（a)中得到的质粒转化入表达菌株，进行蛋白表达，并使用儀柱纯化 该蛋白。 优选地，步骤（a)中，设置在5'端的限制性内切酶位点为化OI，设置在3'端的限 制性内切酶位点为化OI。 优选地，步骤（a)中，蛋白表达载体为祀T28a。 优选地，步骤化）中，表达菌株为大肠杆菌表达菌株Rosseta值E3)。 优选地，该多标签抗原的制备方法包括W下步骤：(a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分别设置限 制性内切酶位点化OI和化OI，将得到的DNA序列克隆至蛋白表达载体祀T28a，测序，得 到包含该SEQIDN0:1序列的质粒祀T28a-MultiTag-G9;化）、将步骤（a)中得到的质粒祀T28a-MultiTag-G9转化入大肠杆菌表达菌株 Rosseta(DE3)，进行蛋白表达，并使用儀柱纯化该蛋白。[001引本专利技术还提供了一种多标签抗原的重组载体，即根据上述步骤（a)得到的pET28a-MultiTag-G90 本专利技术还提供了上述多标签抗原在免疫印迹中的应用。 本专利技术公开的多标签抗原，能够满足大多数免疫印迹反应设置阳性对照的需求。 其具有良好的兼容性和很强的免疫印迹反应特异性，并大大节省了检测成本。 W下将结合附图对本专利技术作进一步说明。【附图说明】 图1示出了本专利技术一个较佳实施例中制备的多标签抗原的免疫印记（Western blot)实验结果。【具体实施方式】W下通过具体的实施例对本专利技术的技术方案做进一步的描述。W下的实施例是对 本专利技术的进一步说明，而不是限制本专利技术的范围。 1、MultiTag-Gg人工基因合成MultiTag-Gg包含 9 种常用检测标签，分别是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His标签。具体的DNA序列分别是：GST标签 His标签catcatcatcatcatcat 18 将上述9种标签DNA序列依次串联在一起通过人工基因合成的方法构建出 MultiTag-Gg完整序列，并在此DNA序列5'端加上化OI限制性内切酶位点CCATGG，3'端 加上化OI限制性内切酶位点CTCGAG，通过化OI和化OI双酶切、割胶回收、T4连接酶连 接克隆至蛋白表达载体祀T28a。MultiTag-Gg完整编码区为1566bp，共含有522个氨基酸， 表达蛋白的理论分子量为5991抓a. 2、MultiTag-G9蛋白的表达与纯化 将测序正确的祀T28a-MultiTag-G9质粒转化入大肠杆菌表达菌株 Rosseta值E3)，挑取单菌落接种至50mlLB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯 霉素34ug/ml双抗性筛选，37 °C，200巧m培养过夜。第二天按照2 :100比例转接至250ml LB液体培养基，加入卡那霉素终浓度50ug/ml和氯霉素34ug/ml双抗性筛选，共转接4瓶， 37°C，200rpm培养至菌液0D600检测数值为0. 8时加入诱导剂异丙基-0 -D硫代半乳糖巧 使其终浓度为0. 1-0. 5mM，诱导培养4h后，4°C700化pm离屯、收集菌体。将此菌体按照每克 加入40ml的比例悬浮于20mMTris.Cl,P册.0,300mM化Cl,10%Glycerol裂解缓冲液，超 声前加入终浓度ImM苯甲基横酷氣，超声波破碎仪进行菌体破碎。超声裂解条件为超声3 秒间隔5秒，30%超声功率，超声15min。当菌液变得清亮时离屯、收集上清液，取样进行聚丙 締酷胺凝胶电泳检测，并采用儀柱纯化MultiTag-Gg蛋白，具体纯化操作步骤参照NiNTA Beads6FF说明书进行，获得纯度约95%的MultiTag-Gg蛋白（得到的MultiTag-Gg蛋白 浓度为 350ug/ml)。[004引3、MultiTag-Gg的免疫印迹应用 纯化好的MultiTag-Gg进行聚丙締酷胺凝胶电泳，按照每泳道上样5ng MultiTag-G9蛋白进行聚丙締酷胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗结合，二抗结合，曝光显色进 行Westernblot免疫印迹反应。9种相对应的商品化标签单抗均能与MultiTag-Gg蛋白进 行灵敏而特异性的免疫印迹反应，结果如附图1所示。 本专利技术获得的多标签抗原蛋白可作为免疫印迹反应的阳性对照，具有良好的兼容 性和很强的免疫印迹反应特异性。一种多标签抗原蛋白即可满足大多数常用标签免疫印迹 反应的阳性对照之需，兼容性强；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多标签抗原，其特征在于，所述多标签抗原包括9种标签，分别为GST标签、HA标签、T7标签、V5标签、Myc标签、StrepII标签、Flag标签、EGFP标签和His标签。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹平生，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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