本发明专利技术公开了一种大肠杆菌锰氧化工程菌及在环境激素降解中的应用，通过构建了大肠杆菌Top10表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大肠杆菌工程菌获得了锰氧化活性，该工程菌株可将Mn2+氧化为高价锰离子，锰氧化活性稳定，产生的锰氧化物为MnO2、MnCO3、KMnO4，菌体、锰氧化物混合体系可迅速、完全的降解环境激素，并且降解产物毒性消失。利用本发明专利技术的菌株及其产生的混合体系可用于环境修复等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及应用微生物
及环境修复领域，具体涉及一种大肠杆菌锰氧化 工程菌，还涉及该基因工程菌在环境激素降解中的应用。
技术介绍
许多种微生物都能快速氧化Μη(II)成锰氧化物，生物锰氧化物较化学合成氧化 锰矿物结晶弱，粒径小，价态高，结构中八面体空穴多，比表面积大，具有比化学合成锰氧化 物更强的吸附氧化和光还原溶解特性，生物锰氧化物能吸附多种重金属，氧化低价态重金 属离子，并降解乙炔基雌二醇等有机污染物，是具有广泛应用前景的环境材料。CotA蛋白广泛存在在多种芽胞杆菌中，其与多铜氧化酶具有许多相似之处，多铜 氧化酶家族包含抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、漆酶、锰氧化酶和其他酶类。漆酶是能够 氧化多种酚类、二胺类的多酚氧化酶类，不同的漆酶底物专一性不同，细菌漆酶具有耐热性 的特点，并且在中性和碱性条件下都具有活性。而真菌漆酶通常在酸性条件下具有活性。 内分泌干扰物（endocrinedisruptingchemicals,EDCs)是指能够干扰生物或 人体内天然激素的合成分泌运输结合反应和代谢等，从而影响生物或人的生殖神经免疫 等功能的外源性化学物质，rocs毒理学关注阈值低，健康危害大，在污水厂进出水、地表 水甚至饮用水中均有报道检出，近年来引起广泛关注。双酚A(bisphen〇l，BPA)，炔雌醇 (17a-Ethinylestradiol，EE2)和壬基酌 (4-n-nonylphenol，NP)被认为是中国污水处 理厂二级出水中生态风险高应优先控制的m)cs。 壬基酚分子式为C9H19C6H40H，相对分子量为220。NP是憎水性物质，在水中溶解度 为5. 43mg/L，环境中的壬基酚是壬基酚聚氧乙烯醚（NPnEO)分解或降解产生的，NPnEO进入 环境后在生物作用下，逐步降解形成短链产物NP2E0、NP1E0和最稳定的产物NP。 NP具有亲油性，这造成了它比较容易吸附于水体底部的淤泥上并被浮游生物摄 取，在生物体内积累，并通过食物链的循环进入人体。其在人体内具有雌激素效应和其他 的生物毒性，对生物体产生的不良作用包括影响内分泌、影响生殖和发育、影响免疫及促癌 作用等。 在NP的生物降解性方面，Staples等对NP的降解进行了实验室内的研究结果证 明，即使是在有氧情况下NP也比NPnEO难于降解，NP结构上的苯环和它的长链烷基造成了 NP的难降解性，但NP苯环上的烷基和羟基，是活化苯环的给电子基团，微生物降解NP的可 能途径是苯酚途径的苯环开环和烷基苯途径的壬烷基断链，但关于NP的降解途径与机制 目前没有定论。 双酚A是合成聚碳酸酯、环氧树脂及聚砜等的重要原料，分子式为C15H1602，分子量 为228,不溶于水，主要用于有机合成生产各种高分子材料，是一种人工合成的化学物质，在 自然界中原本不存在，由于现代社会化工产品的广泛应用，各种家居用品及医药用品中均 能发现BPA的存在。BPA具有雌激素活性，能干扰人体内正常激素的分泌，从而影响生殖功能，同时对 脊椎动物及哺乳类动物均有较严重的负面效应。目前降解BPA的方法包括吸附法，生物 法，电化学法和光催化氧化法，其中生物法应用最广泛，产生的副作用最小。Spivak、Lobus 等用纯的BPA降解菌进行试验，揭示了BPA可能的降解途径，85 %的BPA经由2, 2-二 (4-羟苯基）-2-丙醇，转化为4, 4-二羟基-A-甲基苯乙烯，再转化为4-羟基苯甲酸 +0)2+〇611+6仰11也，15%的8?厶经由2,2-二（4-羟苯基）-1，2-丙二醇，转化为4,4-二羟 基-A-甲基苯乙烯，再转化为4-羟基苯甲酸和2-对羟苯基-2-酮基-1-乙醇。EE2是一种人工合成的雌激素，是避孕药的主要成分，分子式为C2(]H2402,分子量为 296,不溶于水，溶于乙醇，乙醚等。 EE2具有极强的雌激素活性，刘宝敏等研究证明，EE2可导致美国红鱼幼鱼个体异 常，甚至死亡，同时对美国红鱼的肥满度！肾脏指数和肝胰脏指数均有影响。Purdom等人发 现了鱼类的雌雄同体现象，其中EE2是出现该现象的主要原因。对于EE2的治理，目前使用 的方法有活性炭吸附，光降解，臭氧氧化，二氧化锰氧化，生物降解等。其中生物降解中，通 过活性污泥的作用，EE2浓度下降并产生亲水性物质。 环境激素的降解途径可能受到污染物结构、微生物特性及环境条件等多方面因素 的影响。比较重要的几个因素是氧气，温度与pH。Hesselsoe等实验证明，NP在好氧条件下 才能降解。而Tanghe等的实验指出在20°C以上NP的降解才能达到一个较快的速率。Ying 等研究表明BPA厌氧条件下几乎不降解。 这几种典型酚类环境激素污染物具有疏水性、脂溶性及可降解性差等特点，痕量 浓度的污染物可通过食物链经生物富集达到较高的浓度水平，从而给人体健康带来一定的 影响。同时环境激素是激素类物质，它可以通过与人体内激素的竞争，与激素受体结合，从 而影响其表达，扰乱人体的内分泌系统，改变体内激素水平，人如果长期处于内分泌紊乱的 状态，将会导致失眠头痛，月经不调，皮肤衰老等症状。目前对环境激素的生物降解研究主要集中于某些菌体产生的特殊酶类对该类物 质的作用，但有关氧化物与漆酶共同作用降解的研究较少，且已有的技术仅能使环境激素 转化为较低毒性的物质，不能够完全脱毒，仍存在一定的安全问题。处理过程中，随着酶的 活性降低，降解效果也会产生影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种大肠杆菌锰氧化工程菌，通过构建了大肠杆菌 ToplO表面展示芽孢衣蛋白CotA的基因工程菌株，使大肠杆菌工程菌获得了锰氧化活性。 本专利技术另一个目的在于提供了 一种大肠杆菌锰氧化工程菌在环境激素降解中的 应用。利用细菌表面展示的CotA蛋白漆酶活性及培养过程中产生的锰氧化物降解环境激 素，将环境激素无毒化，可解决处理环境激素过程中的毒性残留及降解效果的持效性的问 题，从而达到修复环境的作用。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施： -种大肠杆菌锰氧化工程菌，通过以下步骤构建得到： (1)人工合成cotA基因，具体如下： >cotA ATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGAGCTGCCAATTCCAGAAGTCGCAGAGCCCGTC AAAAAAAACCCAAGACAAACGTATTATGAAATCGCTATGGAGGAGGTGTTCCTCAAAGTTCATAGAGATCTGCCCCCAACCAAGCTATGGACCTATAATGGCAGTTTGCCGGGTCCAACCATTAAAGCGAATCGAAATGAAAAGGTCAAAGTGAAATGGATGAACAAATTG CCGCTGAAACACTTCCTGCCTGTCGATCATACCATTCACGCTGGACACCATGATGAACCCGAAGTCAAAACAGTCGTTCACCTGCATGGGGGCGTGACACCTGCAAGCAGCGATGGTTATCCAGAGGCTTGGTTTTCGCGAGACTTTGAAGCGACCGGCCCCTTCTTTGAACGAGAGGTTTACGAATACCCTAATCATCAGCAAGCATGCACATTGTGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李林，张震，刘瑾，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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