本发明专利技术涉及一种白术根腐病菌检测用引物及快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)取样；(2)第一轮扩增；(3)第二轮扩增；(4)电泳检测。本发明专利技术一种白术根腐病菌检测用引物及快速检测方法，解决了白术根腐病快速蔓延的现状，实现快速、精准的鉴定角担菌引起的白术根腐病的目的，建立起一种能够实现“快速”与“准确”目标要求的角担菌引起的白术根腐病的检测方法，有效提高了检测角担菌引起白术根腐病的及时性和准确度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
白术（Atractylodesmacrocephala)属于菊科、苍术属多年生草本植物，主要分布 于湖北、四川、云南、贵州、浙江等山区湿地。以根茎入药，有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎 的功效，是参苓白术丸、八珍膏、参桂鹿茸丸和香砂养胃丸等中成药的重要原料药，属大宗 药材。You等2013年在《PlantDisease》报道由角担菌（Ceratobasidium.sp)引起的白 术的根腐病是全国白术种植中最大的问题，该菌通过土壤和种苗带菌进行传染，许多种植 田块发病率高达70%，有的整田甚至绝收。白术根腐病的发生和蔓延严重影响白术相关产 业的发展和壮大。传统病原菌的鉴定必须在植株表现出症状后才可以实施，需要病原菌分 离、纯化培养、科赫氏法则验证、形态学观察、生理生化性状等去鉴定，顺利的话完成整个过 程需要大约10-20天，但是一旦产生其他杂菌污染培养基，就会影响鉴别速度，同时长时间 的鉴定耽误防治时机。传统鉴定存在的鉴定不准、耗时、费力等缺点，完全满足不了植保工 作精准、快速防控的要求。为了解决白术根腐病快速蔓延的现状，实现快速、精准的鉴定角 担菌引起的白术根腐病的目的，急需建立一种能够实现"快速"与"准确"目标要求的角担 菌引起的白术根腐病的检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述白术根腐病菌检测用引 物的序列为： 上游引物JDTY1F:5' -ACAGACTGTGGGGACTTTATTGAAC-3'下游引物JDTY1R:5 ' -AGCAGTTGTGAAACTGCAAAGACCT-3 '。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述白术根腐病菌检测用引 物JDTY1F和JDTY1R对白术根腐病菌特异性扩增出337bp的产物。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述白术根腐病菌检测用引 物特异引物序列获得方法为：以感染根腐病的白术植株为样品，采用CTAB法提取样品基因 组DNA，于-20°C保存；以样品DNA为模板，利用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物 ITS1和ITS4经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物； 引物序列为：ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ； ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ； 以第一轮PCR产物为模板稀释后，利用设计的特异引物JDTY1F/JDTY1R进行第二 轮PCR扩增。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述的第一轮扩增的PCR反 应体系总体积为25μ1，反应组分为：2XTaqMasterMix12. 5μ1，10μΜ的上下游引物 ITS1/ITS4各lyl，DNAΙμL，双蒸水9. 5μ1 ;扩增反应程序为：94°C预变性5分钟，94°C变 性30秒，54°C1分钟，72°C1分钟，共30个循环，72°C延伸3分钟，16°C保存。本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述的第二轮扩增的反应体 系总体积为25μ1，将第一轮扩增产物稀释10倍，取1μ1作为模板，反应组分为：2XTaq MasterMix12·5μ1，10μΜ的上下游引物JDTY1F/JDTY1R各ΙμL，双蒸水 9·5μ1 ;扩增反 应程序为：94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C30秒，72°C30分钟，共30个循环，72°C 延伸3分钟，16 °C保存。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物的快速检测方法，其特征在于：按照以下步 骤检测： (1)以感染根腐病的白术植株为样品，采用CTAB法提取样品基因组DNA ; (2)以样品DNA为模板，利用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS1和 ITS4经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物； (3)以第一轮PCR产物为模板稀释后，利用设计的特异引物JDTY1F/JDTY1R进行第 二轮PCR扩增； (4)取适量步骤（3)的扩增产物，采用琼脂糖凝胶，加入GoldviewI型核酸染色 剂，在电压140V下电泳20分钟，于凝胶成像系统下拍照检测，如果存在337bp的DNA特异 性条带，则确定所检测的病菌为角担菌。 本专利技术一种白术根腐病菌检测用引物的快速检测方法，其特征在于：所述步骤 (4)为取7 μ 1扩增产物，采用质量体积比为1%的琼脂糖凝胶，进行电泳分离，100ml琼脂糖 胶加入100 μ1质量体积比的GoldviewI型核酸染色剂。 本专利技术解决了白术根腐病快速蔓延的现状，实现快速、精准的鉴定角担菌引起的 白术根腐病的目的，建立起一种能够实现"快速"与"准确"目标要求的角担菌引起的白术 根腐病的检测方法，有效提高了检测角担菌引起白术根腐病的及时性和准确度。 本专利技术具有以下突出的实质性特点和优点： (1)本专利技术检测灵敏度极高，可以检测到10ag/μ1的白术角担菌基因组DNA，较角 担菌常规PCR检测方法灵敏度提高十万倍，即使在潜伏期或者感染极其轻微的情况下也能 准确检测出角担菌 (2)本专利技术针对白术角担菌基因组DNA可以扩增出337bp的单一条带，特异性强， 不会检测出稻瘟菌、丝核菌、茎点霉、炭疽菌、镰刀菌、链格孢、核盘菌、稻曲菌、白絹菌及白 术基因组DNA，受外源基因组DNA干扰小，精准度高。 (3)本专利技术还有耗时短、操作简单的特点，不需要复杂的检测场所和实验室，完成 整个检测程序约3个小时，常规方法至少需要10-15天。 (4)本专利技术适用于白术引种检疫、脱毒种子种苗质量检测，以及白术抗角担菌引起 的根腐病抗性鉴定早期无症状植株检测。【附图说明】 附图1是利用特异引物JDTY1F/JDTY1R田间实际检测电泳图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但专利技术的实施方式不限于此。 实施例1 本专利技术，包括以下步骤： (1)取样和基因组DNA提取： 2014年4月在恩施土家族苗族自治州咸丰县小村乡白术种植基地随机采集染根 腐病有明显根腐症状的白术苗7株，染病田但外观无明显根腐病症状白术苗7株，然后按照 5-20的顺序为样品进行编号，清理根部土壤，用无菌水冲洗3次，自然晾干，然后按照CTAB 法提取样品DNA ; (2)第一轮扩增： 分别以5-11样当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白术根腐病菌检测用引物，其特征在于：所述白术根腐病菌检测用引物的序列为：上游引物JDTY1F:5’‑ACAGACTGTGGGGACTTTATTGAAC‑3’下游引物JDTY1R：5’‑AGCAGTTGTGAAACTGCAAAGACCT‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：游景茂，林先明，郭杰，郭晓亮，艾伦强，孙扬柳，
申请(专利权)人：湖北省农科院中药材研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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