一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法技术

一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法，该方法首先通过双膜即微滤膜、纳滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，然后通过溶胶脱蛋白、活性炭脱色、真空浓缩结晶、碱溶、脱蛋白脱色、低温等电连续结晶等操作步骤，得到纯度98.5％以上的分支链氨基酸结晶，收率达到80％以上。本发明专利技术采用微滤膜过滤菌体，改变了常规发酵液处理采用的离心、压滤机压滤等方法，菌体去除彻底，过滤液澄清透明；采用溶胶进一步去除发酵液中可溶性蛋白，采用低温等电连续结晶节省了蒸汽用量，提高产品品质。该技术去除了传统的离子交换工艺，避免产生大量高氨氮废水，实现了分支链氨基酸清洁生产。

【技术实现步骤摘要】
一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法
本专利技术涉及一种从发酵液中提取分支链氨基酸的工艺，属于发酵法生产氨基酸的

技术介绍
分支链氨基酸指α-碳上含有分支脂肪烃链的中性氨基酸，包括L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。三种分支链氨基酸都属于必需氨基酸，因其特殊的结构和功能，在生命代谢中具有特别重要的地位，在医药和食品行业具有广泛的应用及商业价值。食品方面，主要用于食品强化，使各种氨基酸平衡，提高食品的营养价值。在医药方面，分支链氨基酸可用于生产复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸的药物，如肝安、肝灵口服液，对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效，并可取代糖代谢而提供能量，是比较昂贵的氨基酸原料药之一。L-亮氨酸还可用于合成具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生理活性的L-亮氨酸Schiff碱配合物。L-异亮氨酸是一种高效的B2防御素表达的诱导物，作为一种免疫刺激物，对粘膜表面的防御屏障在临床上将起到重要的支持作用。L-缬氨酸可作为合成抗癌药物和免疫抗生素的医药中间体。分支链氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制，生产成本高，污染环境，难以实现工业化生产。国内的发酵技术低，影响了产品纯度，不能形成国际市场竞争力；提取污染严重，制约了生产规模。而以发酵法生产具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，形成了氨基酸的垄断地位。微生物直接发酵法生产分支链氨基酸是最具潜力的方法，国内外都有不少的研究。主要的分支链氨基酸生产菌株有：黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、粘质赛氏杆菌、谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌等。微生物发酵法生产L-异亮氨酸最早见于上世纪六十年代，Shiio选育的抗性突变株，产酸14.5g/L；Ikeda选育突变株，以流加醋酸的工艺发酵，可产酸33.5g/L；国内发酵法生产L-异亮氨酸的研究始于上世纪70年代，唐任天选育的突变株，产酸14g/L；刘党生选育的突变株产酸15.1g/L；张磊筛选的突变株产酸20g/L。陈宁等选育的谷氨酸棒杆菌突变株在50吨罐上L-异亮氨酸产量达到47.6g/L。微生物发酵法生产L-缬氨酸最早见于1960年，日本的Udaka和Kinoshita用发酵法生产L-缬氨酸。1961年，Nakayama等选育营养缺陷型菌株来生产L-缬氨酸。国内，1975年中国科学院微生物研究所首次报道了L-缬氨酸产生菌北京棒杆菌突变株AS1.586的选育，摇瓶产酸达到31.9g/L。来彩霞等突变株4-287，摇瓶产酸为26.8g/L。陈宁等选育的谷氨酸棒杆菌突变株在50吨罐上L-缬氨酸产量达到70.3g/L。微生物发酵法生产L-亮氨酸最早见于1967年，Calvo报道的鼠伤寒沙门氏菌抗3-氟亮氨酸突变株发酵液中能积累少量的L-亮氨酸。1986年Tsuchida选育的突变株产酸34g/L。2004年宋超先等选育的黄色短杆菌的突变株TK0303的摇瓶产酸可达28.3g/L。2012年陈宁等选育的谷氨酸棒杆菌突变株在50吨罐上L-亮氨酸产量达到49.2g/L。近年来，随着分支链氨基酸在医药保健、食品和饲料工业中的应用研究的深入和拓展，市场对分支链氨基酸的需求还在不断增长。三种分支链氨基酸虽然都已实现了工业化生产。据统计，2014年国内分支链市场的需求量约为1.2万吨，目前国内分支链发酵水平与世界先进水平的差距主要体现在育种技术落后，菌种产酸不高，分离提取工艺相对落后，高端产品少，产品缺乏国际竞争力。目前，国内分支链氨基酸的提取普遍采用离子交换工艺。该工艺的缺点是工艺复杂、分离杂酸效果差，产品纯度低且得率低；在洗脱和再生后会有大量铵氮废液产生。
技术实现思路
本专利技术目的是解决现有技术存在的废水排放量大、产品收率低、产品质量差的问题，提供一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法。针对上述问题，本专利技术课题组曾开发了一些新的提取工艺技术，如双膜分离技术、凝胶除蛋白技术、低温等电连续结晶技术等，但这些研究还停留在实验室阶段，还未见有工程化的报道。本专利技术提供的双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法，首先通过双膜即微滤膜、纳滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后通过氯化钙和磷酸二氢钠溶胶脱蛋白、粉末活性炭脱色、真空强制循环浓缩结晶、碱溶、脱蛋白脱色、低温等电连续结晶等操作步骤，得到纯度98.5％以上的分支链氨基酸结晶，收率达到80％以上，具体步骤如下：a、将分支链氨基酸发酵液经活菌灭活，调节pH为7.0，加入质量浓度为0.01％-0.2％的明矾和0.1％-0.5％的硅藻土，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的分支链氨基酸微滤液以及菌体蛋白；所述微滤膜分离系统采用陶瓷管式膜分离系统，微滤膜孔径为20～50nm，pH范围为1～14，操作温度为0～80℃，进膜压力与出膜压力差为0.1～1.0Mpa，过滤过程分多次利用纯化水顶洗，直至浓液中分支链氨基酸含量低于2.0g/L后停机，得到除去菌体的分支链氨基酸微滤液以及菌体蛋白。b、将经a步得到澄清的分支链氨基酸过滤液泵入纳滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，操作温度为35℃，操作压力为0.2MPa，得到分支链氨基酸过滤液。所述纳滤膜过滤器采用聚酰胺管式膜分离系统，纳滤膜孔径为0.1～1nm，截留分子量为1000～5000KDa，其操作条件为pH2～12，操作温度20～40℃，进膜压力与出膜压力差为0.2～1.0MPa，得到分支链氨基酸过滤液。c、将b步获得的过滤液加入质量浓度为0.05％-0.1％的氯化钙和0.04％-0.8％的磷酸二氢钠(氯化钙和磷酸二氢钠的摩尔比为3:2)，用25％的氨水调pH至7.0-8.0，搅拌10-20min，离心去除沉淀。d、将c步去除蛋白后的分支链氨基酸上清液加入0.05％-0.5％的活性炭脱色，温度50-60℃，搅拌脱色20-30min，过滤获得脱色液。e、将d步获得的脱色液用乙酸调pH为5.8-6.0后进行减压蒸发，浓缩体积至原液的10％-20％，至有大量结晶析出时停止蒸发，过滤后得到分支链氨基酸粗品和母液；母液喷雾干燥作为农用复合肥；f、将e步得到的分支链氨基酸粗品添加8倍重量的水，用30％NaOH溶液调解pH至9.5-10.0，直至分支链氨基酸粗品完全溶解，搅拌半小时，出现絮状蛋白沉淀后，加入溶液重量0.5％的粉末活性炭，脱色20-30min，过滤，获得上清液。g、将f步获得的分支链氨基酸上清液连续缓慢流加至低温等电结晶罐中，罐内结晶温度5～10℃，通过连续流加6mol/L的盐酸使罐内pH维持在6.0；h、将g步获得的分支链氨基酸结晶混悬液育晶8-10h，过滤获得分支链氨基酸纯品，母液打入d步循环套用。本专利技术的优点和积极效果：与现有工艺相比，本专利技术的方法具有以下优点：1、本专利技术采用微滤膜过滤菌体，改变了常规发酵液处理采用的离心、压滤机压滤等方法，降低了维修费用，降低了工人的劳动强度，除去菌体彻底，过滤液澄清透明，同时较金属膜过滤方式减少了设备投入费用；2、本专利技术去除了传统的离子交换工艺，避免产生大量的废水，实现了分支链氨基酸清洁生产；3、本专利技术采用纳滤膜除蛋白并结合活性炭脱色，减轻了活性炭的用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法，其特征在于该方法首先通过双膜即微滤膜、纳滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后通过氯化钙和磷酸二氢钠溶胶脱蛋白、粉末活性炭脱色、真空强制循环浓缩结晶、碱溶、脱蛋白脱色、低温等电连续结晶操作步骤，得到纯度98.5％以上的分支链氨基酸结晶，收率达到80％以上，具体步骤如下：a、将分支链氨基酸发酵液经活菌灭活，调节pH为7.0，加入质量浓度为0.01％‑0.2％的明矾和0.1％‑1.0％的硅藻土，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的分支链氨基酸微滤液以及菌体蛋白；b、将经a步得到澄清的分支链氨基酸过滤液泵入纳滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，操作温度为35℃，操作压力差为0.2MPa，得到分支链氨基酸过滤液；c、将b步获得的过滤液加入质量浓度为0.05％‑0.1％的氯化钙和0.04％‑0.8％的磷酸二氢钠，氯化钙和磷酸二氢钠的摩尔比为3:2，用25％的氨水调pH至7.0‑8.0，搅拌10‑20min，离心去除沉淀；d、将c步去除蛋白后的分支链氨基酸上清液加入0.05％‑0.5％的活性炭脱色，温度50‑60℃，搅拌脱色20‑30min，过滤获得脱色液；e、将d步获得的脱色液调pH为5.8‑6.0后进行减压蒸发，浓缩体积至原液的10％‑20％时停止蒸发，过滤后得到分支链氨基酸粗品和母液；母液喷雾干燥作为农用复合肥；f、将e步得到的分支链氨基酸粗品添加8倍重量的水，用30％NaOH溶液调解pH至9.5‑10.0，直至分支链氨基酸粗品完全溶解，搅拌半小时，出现絮状蛋白沉淀后，加入溶液重量0.5％的粉末活性炭，脱色20‑30min，过滤，获得上清液；g、将f步获得的分支链氨基酸上清液连续缓慢流加至低温等电结晶罐中，罐内结晶温度5～10℃，通过连续流加6mol/L的盐酸使罐内pH维持在6.0；h、将g步获得的分支链氨基酸结晶混悬液育晶8‑10h，过滤获得分支链氨基酸纯品，母液打入d步循环套用。...

【技术特征摘要】
1.一种双膜连续结晶法分离提取发酵液中分支链氨基酸的方法，其特征在于该方法首先通过双膜即微滤膜、纳滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和部分色素，然后通过氯化钙和磷酸二氢钠溶胶脱蛋白、粉末活性炭脱色、真空强制循环浓缩结晶、碱溶、脱蛋白脱色、低温等电连续结晶操作步骤，得到纯度98.5％以上的分支链氨基酸结晶，收率达到80％以上，具体步骤如下：a、将分支链氨基酸发酵液经活菌灭活，调节pH为7.0，加入质量浓度为0.01％-0.2％的明矾和0.1％-1.0％的硅藻土，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的分支链氨基酸微滤液以及菌体蛋白；b、将经a步得到澄清的分支链氨基酸过滤液泵入纳滤膜过滤器，对过滤液进行除蛋白和脱色处理，所述纳滤膜过滤器采用聚酰胺管式膜分离系统，截留分子量为1000-5000KDa，其操作条件为pH2-12，进膜压力与出膜压力差为0.2MPa，操作温度为35℃，得到分支链氨基酸过滤液；c、将b步获得的过滤液加入质量浓度为0.05％-0.1％的氯化钙和0.04％-0.8％的磷酸二氢钠，氯化钙和磷酸二氢钠的摩尔比为3:2，用25％的氨水调pH至7.0-8.0，搅拌10-20min，离心去除沉淀；d、将c步去除蛋白后的分支链氨基酸上清液加入0.05％-0.5％的活性炭...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宁，徐庆阳，谢希贤，张成林，李燕军，范晓光，马跃超，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12