一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及了一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒。包括偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得，克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入待羧基间隔臂，得到克仑特罗半抗原。本发明专利技术还涉及一种采用所述的克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒分离克仑特罗的样品前处理方法，本方法对克仑特罗具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。

【技术实现步骤摘要】
一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种克仑特罗免疫磁珠试剂盒及其对样品中克仑特罗的分离富集方法。属于免疫学领域。
技术介绍
克仑特罗(Clenbuterol)，异名克喘素、氨哮素，俗名“瘦肉精”，化学名为α[(叔丁胺基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐。克仑特罗是一种β-兴奋剂，20世纪80年代初，美国一家公司开始将其添加到饲料中，增加瘦肉率。猪食用后能提高生长速度，在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此成为瘦肉精；它还使猪毛颜色红润光亮，收腹，卖相好；屠宰后，肉色鲜红，脂肪层极薄，往往是皮贴着瘦肉，瘦肉丰满。但是肥猪饲喂瘦肉精后，会产生四肢震颤无力、心肌肥大、心力衰竭等毒副作用[2]。人如果摄入量过大或无病摄入该药，就可能出现副作用或中毒事故，表现为：肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗。我国和其他许多国家现已禁止在饲料中添加使用克仑特罗，农业部第235号公告中规定克仑特罗及其盐、酯类化合物在所有食品动物和所有可食组织中不得检出，农业部第176号公告中规定克仑特罗禁止在饲料和动物饮用水中使用。克仑特罗残留量常用的仪器分析检测高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)等。由于上述检测方法的样品前处理均需要使用净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗罗里硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱价格昂贵，约为500-2000元/支，且净化步骤繁琐，需要多种有机溶剂。克仑特罗免疫磁珠分离技术由于内含Fe3O4的纳米磁珠的表面修饰官能团可与克仑特罗特异性单克隆抗体结合构成克仑特罗免疫磁珠，通过外加磁场利用抗体的特异性免疫反应从混合溶液中富集和分离克仑特罗，克仑特罗免疫磁珠的净化载体为分散状，可提高特异性单克隆抗体与检测靶物质的结合概率，从而提高样品中克仑特罗的回收率，增加了克仑特罗检测方法的准确度。免疫磁珠的磁珠与抗体之间的结合键为化学结合键，结合程度较为牢固；免疫亲和柱是利用抗原和抗体的特异性结合性质的特殊的SPE小柱。抗体与载体存在的共价键为疏水作用力及离子交换作用力等物理结合力，其结合力度没有免疫磁珠的化学结合键的结合力度大。而且免疫亲和柱的载体为固相，抗体与检测靶物质的结合概率与免疫磁珠相比较会低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，采用该试剂盒进行样品中克仑特罗的分离富集时具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。为实现上述目的，本专利技术提供一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，其包含有：偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。所述克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入待羧基间隔臂，得到克仑特罗半抗原，其结构式如式Ⅰ所示。(式Ⅰ)所述复溶液含有0.2-0.8％牛血清白蛋白、0.01-0.05％吐温-20以及0.02％NaN3的磷酸盐缓冲液或pH7.2～pH7.6的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述百分含量均为质量百分含量，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。所述磁铁产生外加磁场，使偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。本专利技术还提供了分离富集样品中克仑特罗的方法，包括下列步骤：1)用试剂盒进行样品中克仑特罗的分离富集；2)将富集有克仑特罗的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇液，用于检测分析。本专利技术的有益效果如下：1)本专利技术试剂盒的具有较高的特异性和准确性，对克仑特罗的捕获浓度可达到20ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获20ng克仑特罗)，样品添加回收率≥85％；2)本专利技术试剂盒中的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠与液体经磁力作用容易快速分离开来，分离过程简单，可省去离心和过滤等繁琐的操作过程，节约时间，在撤去外加磁场时，磁珠无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；3)磁珠具有一定的机械度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质稳定特点，使其磁性不易下降；4)磁珠的润洗和洗脱分别用去离子水和甲醇，0.1mL的偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠只需1mL甲醇洗脱即可，所用试剂的量较少，磁珠的润洗和洗脱过程较环保。附图说明图1为克仑特罗半抗原合成反应式。图2为克仑特罗半抗原核磁共振氢谱图。具体实施方式实施例1：试剂盒具体组分的制备1.克仑特罗半抗原合成克仑特罗半抗原是由盐酸克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基引入带羧基的间隔臂，得到的克仑特罗半抗原。取0.2-0.5g盐酸克仑特罗加入到2-4mL1mol/L稀盐酸中溶解，再加10mL蒸馏水，搅拌，溶液冷却到0℃，再加入0.1-0.2g亚硝酸盐，搅拌2h，得到重氮盐溶液。取0.3-0.5g对羟基苯丙酸，加入到5mL乙醇中溶解，再加入0.2-0.35g碳酸钾，搅拌溶解，溶液冷却到0℃，加入重氮盐溶液，搅拌4h，停止反应，在向反应液中加入适量的水，用乙酸乙酯萃取，分离掉有机相，加盐酸调节pH值至5，加乙酸乙酯萃取，分离掉水相，干燥蒸干，经过硅胶柱分离纯化，用二氯甲烷：甲醇＝10:1(体积比)的混合溶剂洗脱分离，得到克仑特罗半抗原产物，收率为94.8％。合成反应式如图1所示。取上述克仑特罗半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移δ＝11ppm的位置为羧基氢共振吸收峰，化学位移δ＝2.51、2.79的位置为苯丙三酸的支链氢共振吸收峰，证明间隔臂连接成功，克仑特罗半抗原合成成功。核磁鉴定结果：1HNMR(CDCl3,300MHZ)δ:11.0(s,1H,COOH),7.10-7.75(d,5H,ArH),5.35(s,1H,OH),4.87(m,1H,CH-O),3.65(s,1H,OH),2.51(t,2H,-CH2-),2.79(t,2H,-CH2-),2.9(d,2H,-CH2-),2.0(s,1H,NH),2.00(m,4H,-CH2-),1.27(s,9H,-CH3)。2.免疫原的制备取8-10mL克仑特罗半抗原，溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取25-30mg二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2-0.5mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白(BSA)50mL，使之充分溶解在4mLpH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到克仑特罗免疫原；分装，于-20℃保存备用。3.克仑特罗单克隆抗体的制备1)动物免疫：用上述制备出的免疫原(RAC-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500‑1000混合并溶于2‑(N‑吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

【技术特征摘要】
1.一种克仑特罗免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联克仑特罗单克隆抗体的磁珠是由克仑特罗单克隆抗体与磁珠按质量比为1∶500-1000混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述克仑特罗单克隆抗体是由克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得；所述克仑特罗半抗原是由克仑特罗与对羟基苯丙酸经重氮化反应，在氨基上引入带羧基的间隔臂，得到克仑特罗半抗原，其结构式如式Ⅰ所示：2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述复溶液为含有0....

【专利技术属性】
技术研发人员：聂雯莹，崔海峰，赵正苗，宋灏，徐念琴，何方洋，冯才伟，尚朋朋，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11