一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂，其组成为：以人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和碳酸氢钠组成内核，由聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物为包封层将内核包裹，最外层包覆有壳聚糖或甘露聚糖或它们的混合物。制备方法包括：(1）将重组乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氢钠加入到含有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲溶液中,得到内水相；（2）将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相，取步骤（1）所得内水相加入油相中,高速搅拌形成W/O初乳液；（3）将W/O初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中，高速搅拌形成W/O/W复乳液，再低速搅拌，离心洗涤，收集纳米颗粒，真空冷冻干燥，得到含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂成品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物制剂，特别是一种可鼻腔免疫的、具有pH值敏感性和抗原递呈细 胞靶向性的、包裹乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA)纳米颗粒疫苗制 剂，属于生命科学
技术介绍
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的世界性传染疾病，它是由乙型肝炎病毒（HBV)的 感染而引起的疾病。目前，接种乙肝疫苗是预防和控制HBV传播的最有效的措施之一。最 常使用的乙肝疫苗是由基因重组技术获得的乙肝表面抗原（HBsAg)经纯化、灭活及加入铝 佐剂吸附而成的铝佐剂乙肝疫苗。为了达到持久而有效的免疫应答效果，铝佐剂乙肝疫苗 需在0,1，2个月或0,1，6个月进行三次注射的免疫程序。由于需要专业人员进行注射免疫 接种，且免疫程序复杂，导致相当一部分人难以完成免疫程序，这种现象在不发达地区尤为 严重。此外，铝佐剂乙肝疫苗仅选择性诱导机体产生体液免疫应答，而不能有效诱导产生细 胞免疫应答，不能有效清除细胞内存在的HBV病毒；也不能产生粘膜免疫、产生粘膜抗体， 防止病毒通过粘膜进行入侵。因而，临床需要研发免疫方法简便的、免疫效果更强的新型乙 肝疫苗，使更广泛的人群受到有效的保护。与注射接种相比，鼻腔粘膜免疫接种方法简便， 不需要侵入接种，可避免专业人员参与，自己即可进行接种；同时，也可避免注射时针刺导 致的疼痛和损伤，患者依从性好，尤其对于儿童。此外，鼻腔粘膜免疫接种可减少使用污染 针头导致的意外风险，增加疫苗接种的安全性，降低接种费用，适合大范围人群免疫接种。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂，克服了铝佐 剂乙肝疫苗需要注射带来的诸多问题及其不能诱导粘膜免疫和细胞免疫的缺点。 本专利技术的另一目的是提供一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的制备 方法。 具体的，本专利技术的一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的组成是这样 的，以稳定性保护剂人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和释放促进剂碳酸氢钠组成内核，由 高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物作为包封层将内核包裹，最外层包覆有壳聚糖 或甘露聚糖或它们的混合物。 本专利技术中，重组乙肝表面抗原为酵母乙型肝炎表面抗原或中国仓鼠卵巢细胞分泌 的乙型肝炎表面抗原。 本专利技术中，聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物分子量为9. 0 X 103~8. 7 X 10 4,其中 聚乳酸与聚羟基乙酸（PLA:PLG)的质量比为（50:50)~（85:15)。 本专利技术中，壳聚糖为低分子量壳聚糖，分子量低于5000 Da。 本专利技术中，甘露聚糖为从酿酒酵母提取的细胞壁多糖，分子量35000 - 60000 Da。 本专利技术的含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤： (1) 将重组乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氢钠加入到含有聚乙烯醇的磷酸盐缓 冲溶液中，混合得到内水相； (2) 将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相，取步骤（1)所得内水 相加入油相中，高速搅拌形成W/0初乳液； (3) 将W/0初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中，高速搅拌形成W/0/W复乳液；再 低速搅拌6~8小时，离心洗涤，收集纳米颗粒，真空冷冻干燥后，即可得到含重组乙肝表面 抗原的纳米颗粒疫苗制剂成品；外水相中或者添加壳聚糖和甘露聚糖。 本专利技术的制备方法，步骤（1)，乙肝表面抗原与血清白蛋白的质量比为1 : 5 ;内水 相乳化剂聚乙稀醇浓度为5 mg/ml~20 mg/ml ;内水相中碳酸氢钠的浓度为1.25 mg/ml~ 5 mg/ml〇 本专利技术的制备方法，步骤（2)，内水相与油相的体积比为1: (2~4)。 本专利技术的制备方法，步骤（2)，搅拌转速为8500~20000转/分；以15000转/ 分为佳；搅拌时间为30~300秒；第（3)步中搅拌乳化的转速为8500~15000转/分，以 12000转/分为佳；搅拌时间为10~20分钟。 本专利技术的制备方法，步骤（2)，有机溶剂是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液， 其中，有机溶剂是二氯甲烷和丙酮的混合液时，二氯甲烷与丙酮的体积比为75:25。 本专利技术的制备方法，油相中聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物的浓度为50~100 mg/ml。外水相分散介质聚乙稀醇的浓度为5 mg/ml~50 mg/ml，可加入浓度为20~50 mg/ml的无机盐，以增加抗原的包封率；外水相中壳聚糖的浓度为5~50 mg/ml，以20 mg/ ml为佳；外水相中甘露聚糖的浓度为2~20 Pg/ml，以10 Pg/ml为佳。本专利技术中内水相、 外水相的pH值为7.0。 本专利技术选择人血清白蛋白作为稳定剂保护乙肝表面抗原在纳米颗粒制备过程中 的稳定性；然后使用生物可降解高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物（PLGA)为载体 材料包封稳定剂和重组乙肝表面抗原，制备得到重组乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羟基乙酸 嵌段共聚物纳米颗粒，可以有效保证在纳米颗粒制备和释放过程中乙肝表面抗原的免疫原 性不被破坏。 本专利技术提供的纳米颗粒疫苗制剂，将乙肝表面抗原包裹在具有pH值敏感性和抗 原递呈细胞靶向性的PLGA纳米颗粒内，这种纳米颗粒疫苗制剂是将碳酸氢钠与抗原一起 包裹在PLGA纳米颗粒内，在中性pH，纳米颗粒释放抗原速度很慢，但是，酸性pH (溶酶体 中）条件下，纳米颗粒会快速释放抗原。因而，抗原的释放会受到外部环境的调节，在细胞 外部，抗原释放很慢，可避免抗原在进入抗原递呈细胞前被蛋白酶降解。只有在细胞内的溶 酶体中才会快速释放抗原。并且，本专利技术提供的纳米颗粒表明经过了甘露聚糖和壳聚糖修 饰，这种修饰具有两个优点：（1)可以增强纳米颗粒靶向抗原递呈细胞的能力，增强抗原递 呈细胞对纳米粒的摄取；（2)可以增加纳米颗粒在鼻腔粘膜上的滞留时间，促进抗原进入 体内，增强纳米颗粒疫苗的免疫应答。本专利技术提供的表面经过修饰的、具有pH值敏感性和 抗原递呈细胞靶向性的纳米颗粒疫苗适宜于鼻腔免疫，可诱导产生HBsAg特异性的强体液 免疫应答、粘膜免疫应答和细胞免疫应答，明显优于铝佐剂乙肝疫苗，可以克服铝佐剂乙肝 疫苗的缺点。 本专利技术通过在纳米颗粒表面包被甘露聚糖和壳聚糖，不仅可以增强纳米颗粒靶向 抗原递呈细胞的能力，增加抗原递呈细胞对纳米颗粒的摄取，而且，可以增加纳米颗粒在鼻 腔的滞留时间，促进纳米颗粒透过鼻粘膜，诱导抗原特异性免疫应答。更为重要的是甘露聚 糖和壳聚糖修饰的pH敏感性纳米颗粒在抗原递呈细胞内释放抗原存在可调控的两种释放 模式，在溶酶体中的快速释放和在细胞外部环境中的缓慢释放。 本专利技术取得的有益效果是：通过添加稳定性保护剂制得的纳米颗粒，颗粒规则无 粘连，平均粒径在〇. 5 - 1. 5 μ m，载药量、包封率高。作为鼻腔接种的预防乙肝病毒传播的 纳米颗粒制剂，抗原稳定性好，免疫活性高，易于形成混悬液，适合于鼻腔接种免疫健康人 群，不仅可提高人群HBsAb水平，诱导粘膜免疫，预防乙肝病毒的侵入；而且可以诱导细胞 免疫，用于清除感染的细胞内乙肝病毒。因此，本制剂不仅可以预防乙肝病毒的传播，又可 达到治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者的效果。其制备过程简单，易行。【附图说明】 图1为甘露聚糖和壳聚糖修饰的、PH敏感的、包裹HBsAg的聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂，其特征在于组成为：以稳定性保护剂人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和释放促进剂碳酸氢钠组成内核，由高分子材料聚乳酸‑聚羟基乙酸嵌段共聚物作为包封层将内核包裹其中，最外层包覆有壳聚糖或甘露聚糖或它们的混合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺进田，李泽，熊芳芳，王改珍，
申请(专利权)人：河北师范大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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