一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测引物及其组合物制造技术

本发明专利技术提供一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测引物及其组合物，属于贫血症检测技术领域。本发明专利技术基于LAMP反应，采用等位基因特异性LAMP(Allele-Specific LAMP)技术，针对编码血红蛋白β链的基因序列的野生型和突变型分别设计特异性引物，可快速准确的检测镰形红细胞贫血症涉及的基因型。本发明专利技术提供的检测引物及其组合物成本低廉、检测时间短、准确性高，易于推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及贫血症的检测
，尤其涉及一种镰刀形细胞性贫血症的基因检 测引物及其组合物。
技术介绍
镰刀形红细胞贫血症是一种常染色体隐性基因遗传病，病患者的红细胞在镜下呈 现出镰刀形，其携带氧功能只有正常红细胞的一半，在缺氧状态下，这种不正常的红细胞会 破裂造成严重贫血，甚至引起病人死亡。镰刀型细胞贫血症主要发生在非洲及美国黑人中， 我国的南方地区近年来也有病例报道。分子生物学研究发现，该病的发病原因是编码血红 蛋白β亚基第六个氨基酸的基因序列由GAG突变成GTG，导致血红蛋白β链该处的谷氨酸 突变成缬氨酸，从而引起血红蛋白的功能异常。这种突变表现出一定的共显性，只携带一个 突变基因的人群一般表型正常，此类型往往不需要治疗，但其血液中还是存在一定比例的 镰状红细胞，在缺氧状态下，这种红细胞也会破裂导致一系列严重后果，因此这类携带者 应避免尚山等缺氧环境。 目前对镰刀型贫血的基因检测主要是直接测序法和PCR-限制性片段长度多态性 法（PCR-RFLP)。直接测序法可以直接获得突变位点的序列，比较直观，但操作繁琐，耗时长， 且需要使用昂贵的试剂和仪器，因此并不适合大规模推广；PCR-RFLP则是在PCR反应后酶 切产物，操作比较繁琐，当样本量较大时，很有可能引起样本的交叉污染，因此也不是大样 本研究或检测的最佳手段。因此，需找一种新的适于大量检测样本的镰刀型贫血检测方法 和引物很有必要。 环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)技术是日本 科学家于2000年开发出来的一种恒温扩增技术，针对靶基因的六个区域设计四条特异性 引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，可在十几分钟到一小时之内产生109-101(]数 量级的产物，反应结束后通过肉眼直接观察体系状态的改变来判定待测样本的基因型，无 需开管，因此大大简化了操作步骤，同时又可以有效避免样本交叉污染，而且，仅需普通水 浴锅即可开展检测，又节约了大量的检测成本。因此，采用LAMP方法检测镰刀形细胞性贫 血症是一种新的研究方向。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是现有的镰刀形细胞性贫血症检测方法不理想，不适于大规 模推广使用。 为解决上述问题，本专利技术在LAMP的基础上采用等位基因特异性环介导等温扩增 (Allele-SpecificLAMP)技术，针对编码血红蛋白的基因序列进行检测，从而判断待检测 人群是否携带可导致镰刀形细胞性贫血症的突变基因。本专利技术提供了一种适于推广使用的 镰刀形细胞性贫血症基因检测引物及其组合物。 本专利技术的第一个目的在于提供一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测引物，用于检 测编码血红蛋白的基因序列，包括以下引物： 5' -GTCGACTGTTGCTTACACTTTC-3'（SEQIDNo. 1，以下简称F3) 5' -GCCCAGTTTCCATTTGCCT-3'（SEQIDNo. 2,以下简称B3) 5' -TCTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3'（SEQIDNo. 3,以下 简称FIPA) 5' -ACTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC-3'（SEQIDNo. 4,以下 简称FIPT) 5' -TGAACGTGGATGCAGTTGGTGGGAGCCTCTCTTATAACCTTGATACC-3'(SEQIDNo. 5， 以下简称BIP)。 本专利技术提供的引物中，针对编码血红蛋白β链的基因序列的野生型和突变型分 别设计特异性引物FIPA和FIPT，在这两个特异引物的特异碱基的附近均添加了一个新的 突变，增加了引物的特异性，进一步减少非特异性的影响，提高了检测的准确性。 本专利技术的第二个目的在于提供一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测组合物。所述 组合物包括上述的引物，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。 进一步地，所述组合物分为两个体系，分别为检测编码血红蛋白基因序列中A等 位基因的体系A和检测T等位基因的体系T; 体系A中包括F3、B3、FIPA、BIP、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水； 体系T中包括F3、B3、FIPT、BIP、dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。 优选地，两个体系中均还包括用于显示体系颜色的指示剂。 优选地，所述指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物或者为羟基萘酚蓝。 优选地，指示剂在体系A和体系T中的浓度相同。若指示剂为钙黄绿素和氯化锰 的组合物，妈黄绿素为25μM，氯化猛为0. 5mM。若指示剂为羟基萘酸蓝，其为120μM。 进一步地，所述两个体系中均还包括添加剂；所述添加剂为甜菜碱或二甲基亚砜 中的一种。体系中的甜菜碱或二甲基亚砜的存在，防止碱基堆积，减少引物二聚体的形成以 及模板之间的复杂二级结构的形成，使DNA双链更易打开。添加剂在两个体系中的浓度相 同。若添加剂为甜菜碱，其浓度为大于〇,小于等于1Μ;若添加剂为二甲基亚砜，其浓度为大 于0,小于等于10% (体积分数）。 优选地，所述甜菜碱的浓度为0. 8Μ。 优选地，所述两个体系中：F3的浓度相同，为0. 4μΜ;Β3的浓度相同，为0. 4μΜ; BIP的浓度相同，为1.6μΜ;体系Α中FIPA的浓度和体系Τ中FIPT的浓度相同，均为 1. 6μΜ〇 优选地，所述两个体系中缓冲液的浓度相同，其包括：Tris-HCl20mM，KC1 50mM， (NH4) 2S0410mM，MgS044mM，Tween_2〇0· 1 % (体积分数）。 优选地，两个体系中dNTP的浓度相同，均为1. 4mM。两个体系中Bst聚合酶均为 8U〇 本专利技术的第三个目的在于提供一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测方法。所述检 测方法，使用上述的镰刀形细胞性贫血症的基因检测组合物，具体为：将待检测的核酸分别 加入到体系A和体系T中，得到的两个反应体系于55~70°C下反应，反应结束后观察体系 的变化。 进一步地，所述待检测的核酸在两个体系中的浓度一致，均为0. 8~4ng/μL。 优选地，反应结束后，将两个体系分别进行灭活处理。灭活处理使得体系中的酶失 活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增。 优选地，反应温度为60 °C。 优选地，所述反应时间为40~120min。 在本专利技术的反应体系中，反应前体系为澄清状态，发生阳性反应时，镁离子与副产 物焦磷酸形成沉淀，体系产生肉眼可见的沉淀，变为浑浊状态。观察体系状态的变化可以直 接判定是否发生扩增反应。 当体系中存在指示剂时：（1)若指示剂为羟基萘酚蓝，反应前体系中的镁离子与 dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH 发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色；（2)若指示剂为钙黄绿素和氯化锰的组合物 时，反应前钙黄绿素与氯化锰中的锰离子结合，体系呈现黄色；当有阳性反应时，副产物焦 磷酸与锰离子结合生成沉淀，钙黄绿素与体系中的镁离子结合，颜色逐渐由黄色变为荧光 绿色。观察反应体系颜色和/或状态的变化可以直接判定是否发生扩增反应。 本专利技术具有的优点和积极效果是：本专利技术在LAMP基础上采用Allele-S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种镰刀形细胞性贫血症的基因检测引物，其特征在于：包括以下引物：5′‑GTCGACTGTTGCTTACACTTTC‑3′(SEQ ID No.1，以下简称F3)5′‑GCCCAGTTTCCATTTGCCT‑3′(SEQ ID No.2，以下简称B3)5′‑TCTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC‑3′(SEQ ID No.3，以下简称FIPA)5′‑ACTGGAGTCAGATGCACCATTCTGACATAACAGTGTTCACTAGC‑3′(SEQ ID No.4，以下简称FIPT)5′‑TGAACGTGGATGCAGTTGGTGGGAGCCTCTCTTATAACCTTGATACC‑3′(SEQ ID No.5，以下简称BIP)。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪大为，
申请(专利权)人：北京晋祺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11