一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。其中，所述试剂盒包括：RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒和RPA检测试剂盒；所述RNA提取试剂盒用于提取待测样品的RNA作为检测模板；所述RNA反转录试剂盒用于对所述检测模板中的RNA进行反转录得到cDNA；所述RPA检测试剂盒包括引物和荧光染料，所述引物用于对所述cDNA进行扩增得到扩增DNA序列，所述引物包括正向引物和反向引物，所述荧光染料用于对所述扩增DNA序列进行荧光检测。本发明专利技术提供的检测试剂盒及检测方法能够实现快速简便的检测禽流感病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉生物
，尤其涉及一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒及检 测方法。
技术介绍
禽流感（Avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的 急性、烈性传染病，除了可感染禽类外，还可感染人、猪和马等多种动物，被0ΙΕ列为A类传 染病。禽流感病毒（AIV)属于A型流感病毒，禽流感病毒（AIV)变异频繁，血清亚型众多。 根据HA抗原性差异分为16个HA亚型。抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护 性，使得禽流感频繁暴发，且由于禽流感潜伏期极端，爆发突然，多不见任何临床症状而突 然死亡，发病率和死亡率可高达100%，成为养禽业的一大毁灭性疾病。目前，我国部分地区以H9亚型为主的中低致病力禽流感的流行，能造成鸡产蛋量 下降，给我国养禽业造成很大的经济损失，这一点已引起国内各界的广泛关注。另外禽流感 还可感染人，研究表明人类流感首先来自家禽，家禽流感传染给人类，有些感染者严重的导 致死亡。近年在我国流行的H7N9流感也是在禽类上无临床症状，一旦感染人就表现高致病 性，这就为我们日常的疾病监控预防提出要求，必须有一种简单快速适用的检测方法能够 应用。 -些早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的前提条件，尤其是针对Hl、H3和H9 亚型的AIV。病毒分离、血清学试验至今仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法，但 这些方法操作繁琐复杂；难以对AIV进行快速诊断；十分不利于AIV的防治。聚合酶链式 反应（PolymeraseChainReaction，PCR)已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的 技术手段之。PCR是一种体外基因扩增技术，可以在数小时内对某段基因进行扩大数百万 倍。该技术特异性强、敏感性高。为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。但 常用的PCR检测需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测 的要求，例如不能进一步满足一线兽医人员的快速检测。 因此，需要一种能够快速简便的检测禽流感病毒的检测试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在解决现有技术中存在的禽流感病毒检测繁琐难以满足需求的 问题，为此本专利技术提供了一种Hl、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒及检测方法。 本专利技术提供的一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括： RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒和RPA检测试剂盒； 所述RNA提取试剂盒用于提取待测样品的RNA作为检测模板； 所述RNA反转录试剂盒用于对所述检测模板中的RNA进行反转录得到cDNA; 所述RPA检测试剂盒包括引物和荧光染料，所述引物用于对所述cDNA进行扩增得 到扩增DNA序列，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物的序 列如下： 所述荧光染料用于对所述扩增DNA序列进行荧光检测。 优选的，所述试剂盒还包括试纸条，用于检测所述扩增DNA序列。 优选的，所述试纸条为快速显色试纸条。 本专利技术还提供了一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测方法，其中，所述方法包括： 提取试剂提取待测样品的RNA作为检测模板； 对所述检测模板进行反转录得到得到cDNA; 对所述cDNA进行扩增得到扩增DNA序列； 对所述扩增DNA序列进行荧光检测得到扩增曲线； 根据所述扩增曲线判断检测结果。 优选的，所述方法还包括在对所述cDNA进行扩增得到扩增DNA序列后，通过试纸 条检测所述扩增DNA序列，根据试纸条的显示结果判断检测结果。 优选的，若所述试纸条显示条带，则判断所述检测结果为阳性。 优选的，所述试纸条为快速显色试纸条。 本专利技术提供的禽流感检测试剂盒及检测方法通过在试剂盒中使用RPA检测技术， 检测禽流感病毒时在RPA扩增体系中加入荧光试剂便可实现检测模板扩增的实时监测，最 后通过得到的扩增曲线来判断检测的结果。这种检测禽流感的试剂盒及检测方法极大地缩 短了检测时间，简化了检测步骤，能够实现快速简便的检测禽流感病毒。【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发 明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。 图1为本专利技术提供的一种HI、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒结构图； 图2为本专利技术提供的一种Hl、H3和H9型禽流感病毒检测方法流程图； 图3为本专利技术实施例6提供的Hl、H3和H9单基因扩增图； 图4为本专利技术实施例7提供的检测模板特异检测图； 图5为本专利技术实施例8提供的H1流感灵敏度检测图； 图6为本专利技术实施例8提供的H3流感灵敏度检测图； 图7为本专利技术实施例8提供的H9流感灵敏度检测图； 图8为本专利技术实施例9提供的试纸条快速检测PCR产物结果图； 图9为本专利技术实施例9提供的H1流感HA基因RPA产物琼脂糖胶结果图； 图10为本专利技术实施例9提供的H3流感HA基因RPA产物琼脂糖胶结果图； 图11为本专利技术实施例9提供的H9流感HA基因RPA产物琼脂糖胶结果图。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附 图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术 一部分示例性的实施例，而不是全部的实施例，仅用于解释本专利技术，而不能解释为对本专利技术 的限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。 本专利技术提供了各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他 工艺的可应用性/或其他材料的使用。除非另有说明，本专利技术的实施例将采用本领域技术 人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，实施例中未注明具体实 验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。 重组酶聚合酶扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术是模拟 生物体内DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来，利用重组酶和引物形成 微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板 DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需自由的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用 下进行复制延伸，形成新的DNA互补链反应产物也是以指数级增长。与常规PCR反应不同， RPA反应所需引物长度通常为30-35bp。引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级 结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加，引物序列的设计与选择对RPA的结果 至关重要。 本专利技术实施例提供的H1、H3、H9型禽流感病毒检测试剂盒，在GenBank中搜索三种 亚型HA基因序列，设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测，筛选、优化出3对引物及 其反应体系，所扩增的DNA片段大小分别为HlHA159bp、H3HA268bp和H9HA144bp。结果表 明，通过扩增条当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种H1、H3和H9型禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒和RPA检测试剂盒；所述RNA提取试剂盒用于提取待测样品的RNA作为检测模板；所述RNA反转录试剂盒用于对所述检测模板中的RNA进行反转录得到cDNA；所述RPA检测试剂盒包括引物和荧光染料，所述引物用于对所述cDNA进行扩增得到扩增DNA序列，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物的序列如下：H1F：5’‑AAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGC‑3；H1R：5’‑ATGGATGGTGAATGCCCCATAGCACGAGGACTTC‑3；H3F：5’‑TAGTTGCCTCATCCGGCACCCTGGAATTTACCCA‑3′；H3R：5’‑GATGCTTGAACATATAGGTTGGTTTGGTCCCTGTC‑3′；H9F：5’‑TGGAGACAATTCGGAACGGGACCTATAACAGGAG‑3′；H9R：5’‑ACCCCATTGCAACCACAAGAGATGAGGCGACAGT‑3；所述荧光染料用于对所述扩增DNA序列进行荧光检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李红丽，伏显华，王红宝，郭雪丽，孙爱娟，
申请(专利权)人：山西省农业科学院畜牧兽医研究所，北京佳华戴维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山西;14