一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法技术

本发明专利技术公开了一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵蓝莓汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的蓝莓汁。本发明专利技术得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的蓝莓汁中，吡咯喹啉醌含量达到96-128ng/mL，纳豆激酶活力达到546-955U/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工程与发酵领域，具体涉及一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法。
技术介绍
纳豆由大豆经纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)发酵而成，具有多重生理功效：①纳豆对心血管系统的作用：纳豆中一种标志性生理活性物质纳豆激酶(Nattokinase，NK)是能够溶解血栓的蛋白质，由275个氨基酸残基组成，分子量27KD左右，无毒、无副作用，是一种丝氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超过溶栓制剂尿激酶。纳豆激酶除具有直接溶栓作用外，还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力，从而间接表现其溶栓活性。纳豆中亚油酸占全脂质的50％，亚油酸能够降低血浆中胆固醇含量，有预防动脉硬化、心脏病和高血压的功效，具有血栓溶解作用；②纳豆对消化系统的作用：大豆蛋白质经纳豆酶的作用转化成可溶性多肽和氨基酸，有利于人体吸收。1g纳豆中含有10亿个以上纳豆菌，纳豆菌繁殖快，能消耗肠道中的氧，可以抑制引起肠内异常发酵的痢疾杆菌等腐败菌，促进乳酸菌繁殖，调节肠内细菌平衡，预防痢疾、肠炎和便秘等。大豆经过纳豆菌发酵蓄积了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶和脲酶等酶群，这些生物酶在消化系统中能够有效调理促进消化吸收。纳豆芽孢杆菌在通过分解利用大豆蛋白进行繁殖的过程中，可以产生大量酵素、维生素、多聚谷氨酸和多聚果糖等粘性物质，其被覆在胃肠粘膜表面起到保护作用，饮酒时可缓解酒醉。纳豆菌还能杀死肠道出血性大肠杆菌；③纳豆对免疫系统的作用：通过接种纳豆菌的动物实验发现，纳豆可以提高机体抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，还可以诱发机体干扰素生成，增强机体免疫力；纳豆中含有活性物质如皂草甙、维生素B2、维生素E等，每天食用可除去体内致癌物质，预防癌症发生，并可软化血管，促进肌肤光滑；④促进骨骼发育：维生素K2可促进钙与蛋白质结合从而促进骨骼形成，在骨骼形成过程中起着重要作用，而纳豆中维生素K2含量是其他发酵食品的数百倍，有预防骨质疏松、腰痛等老年病的功效。近年发现纳豆还具有其它更丰富广泛的生理功效，源于其另一种标志性生理活性物质——吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是继黄素核苷酸和烟酰胺核苷酸之后在细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，化学名称为4,5-二氢-4,5-二氧化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸，又名Methaxatin。虽然自然条件下仅少数细菌如Methylovorus、Deinococcus radiodurans、Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae等能够合成PQQ，但在各种植物、动物以及人体内都发现含有微量PQQ。日本科学家测定了26种常见食物中的PQQ含量，发现1克食物中PQQ含量在3.65-61纳克不等，例如，蔬菜中的欧芹、青椒，水果中的奇异果、木瓜，饮品中的绿茶、乌龙茶，以及人们常吃的豆腐。值得注意的是，日本传统食物纳豆当中PQQ含量最高，达到61纳克/克。PQQ作为一种普遍存在于动物和植物组织中的氧化还原酶辅基，虽然含量非常低，但作用重要，不仅是一种新发现的线粒体呼吸链组分，参与催化生物体内氧化还原反应，还具有非常多样的生物活性，缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍，被认为是一种新型维生素。PQQ对哺乳动物的主要生理作用有：①全面提高人体免疫功能：PQQ作为人类发育的必要因子，能刺激人体细胞生长，尤其是激活人体B细胞、T细胞，提高人体免疫功能；②防治肝损伤：PQQ能显著降低血清胆红素和谷丙转氨酶水平，调理肝损伤，对肝脏疾病有极好疗效；③减少自由基对人体的伤害：PQQ是一种氧化还原酶辅基，参与生物体内氧化还原反应，能有效清除体内自由基，减少自由基对人体伤害所引发的各种疾病，如心脏病、癌症以及各类炎症；④调理各种神经系统疾病：PQQ在体内能促进神经因子合成，调理各种神经系统疾病；⑤促进氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的辅基，参与呼吸链电子传递，在人体内能促进氨基酸吸收；⑥促进生长因子合成：生长因子是人类生长的激素，PQQ能刺激人体细胞生长，增加细胞密度，微量PQQ就能提高生物体组织的代谢能力和生长机能；⑦防治老年痴呆症：PQQ具有修复神经纤维、活化神经元、激活休眠神经细胞的能力，能有效防治老年痴呆症和改善记忆力；⑧促进谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促进机体谷胱甘肽合成，防止白内障发生和肝脏胆红素积累；⑨极强的抗癌功能：PQQ激活自然杀伤细胞(NK)细胞为ANK细胞，使其具有杀肿瘤作用；使NK细胞等免疫细胞聚集，更有效地杀灭肿瘤细胞；封闭肿瘤细胞载铁蛋白受体，阻断其功能，抑制肿瘤生长、转移；破坏肿瘤细胞脂质双层，使肿瘤细胞溶解死亡；阻止肿瘤细胞DNA复制，促其凋亡。在天然食品中，纳豆独有NK，并且PQQ含量最丰富。纳豆中的NK和PQQ由纳豆芽孢杆菌产生。纳豆是日常健康食品，纳豆芽孢杆菌是公认安全的食品级微生物(GRAS微生物)，对纳豆芽孢杆菌进行定向选育，然后与乳酸菌共发酵，制备富含NK和PQQ的食品，对于人们在日常饮食中补充NK和PQQ、充分发挥NK和PQQ的生理调理作用具有重要意义。蓝莓(Vaccinium Spp)营养丰富，不仅富含常规营养成分，而且还含有极为丰富的黄酮类和多糖类化合物。花青素是一种重要植物水溶性色素，属于纯天然抗衰老营养补充剂，是目前人类发现的最有效的抗氧化生物活性剂，蓝莓中花青素含量非常高，同时花青素种类也十分丰富，高丛蓝莓果中含花青素成分高达15种；蓝莓中有机酸含量约占总酸含量一半以上。有机酸中大部分是枸橼酸，其他有熊果酸、奎宁酸和苹果酸等，需要着重一提的是熊果酸，熊果酸又称乌索酸，属于弱酸性五环三萜类化合物，是多种天然产物的功能成分，具有广泛生物学活性，特别在抗肿瘤等方面作用突出；蓝莓中含有多种多酚类物质，酚酸就是其中重要一类，酚酸类物质是酚类物质的一种，具有良好营养功能和抗氧化等药理活性，蓝莓中酚酸有十余种，其中含量最高的是绿原酸，又称咖啡鞣酸，研究发现其对多种癌症(肺癌、食管癌等)有明显抑制作用，同时抗氧化作用也非常强大；超氧化物歧化酶(SOD)是广泛存在于生物体内的一种酸性金属酶，是生物体内重要的自由基清除剂，其主要作用是能专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基，蓝莓中SOD含量丰富；果胶能有效清除人体内未消化的食糜和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑506；2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS‑Met‑；3)将纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑506和干酪乳杆菌LcS‑Met‑共发酵蓝莓汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的蓝莓汁。

【技术特征摘要】
1.一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的制作方法，其特征
在于，包括以下步骤：
1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌
10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代
培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为
纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-506；
2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型
的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Met-；
3)将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-506和干酪乳杆菌LcS-Met-共发
酵蓝莓汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的蓝莓汁。
2.根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的
制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备
2个平板豆芽汁蓝莓汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗
PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B；
②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中
一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影
印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼
可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平
板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直
径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯
喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯
喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的
制作方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁蓝莓汁固体培养基
以1L计，由以下量的组分组成：
4.根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵蓝莓汁的
制作方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷
型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个
将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板
D；②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另
一个平板，使平板...

【专利技术属性】
技术研发人员：张哲滔，阮子琦，莫凡，邓惟，吴渊，
申请(专利权)人：杭州元佩特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33