本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽及其应用。所述表位肽的氨基酸序列为AVMAGIVRAAK，该表位肽与HLA-A*1101分子亲和力高，能活化CD8+T细胞、诱导其增殖和分泌IFN-γ。本发明专利技术表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学
，特别涉及结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽及其应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌感染后诱发、全球感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。仅2012年，全球新发结核病患者达860万，死亡130万。结核病疫情的新特点在于：耐药结核病例出现并呈蔓延之势；结核与艾滋病共感染情况愈演愈烈。针对这两类患者，目前并无有效的防治措施。中国是世界上结核病负担最重的国家之一，研发适合中国人群的结核病疫苗和治疗药物已时不我待。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是胞内寄生菌，对其有效控制主要依赖于细胞免疫，尤其是T细胞免疫。人体内T细胞主要分为CD4+T(Th)细胞和CD8+T(CTL)细胞两大亚群，大量研究已经证明，这两种T细胞亚群对于控制结核菌感染都具有重要作用，其中CD8+CTL更是清除结核菌的主力军。T细胞无法识别完整的结核菌和蛋白抗原，而是识别经过抗原递呈细胞摄取和加工后释放出的结核表位肽。表位肽是抗原中引起免疫应答的核心部份，也称为抗原决定簇，它与抗原递呈细胞表面的HLA分子结合形成肽-HLA复合物并被递送和表达在抗原递呈细胞表面，进而活化T细胞，诱发T细胞免疫反应。CD4+T细胞识别HLA II类分子递呈的表位肽，而CD8+T细胞识别HLA I类分子递呈的表位肽。T细胞对表位肽的识别及其活化要求表位肽与抗原递呈细胞表面HLA分子稳定结合，而肽与HLA分子的亲和力是形成肽-HLA复合物的关键，因此制备诱发T细胞免疫的治疗药物和疫苗，首要步骤是筛选出高亲和力的肽，进而鉴定出具有免疫活性的表位肽。表位肽可以完全通过人工合成获得，研发周期短；由于剔除了表位肽以外病原体其他有害成分，安全性良好；还可以将多个表位肽串联使用，加强免疫效果和减少免疫逃逸。目前已知的结核菌CTL表位肽主要是在欧美人群中鉴定，多为HLA-A*0201限制性，而对于结核病流行最严重的非洲和东南亚人群，并没有合适的表位肽可使用。在中国，HLA-A*1101是人群中基因频率最高的HLA分子，鉴定HLA-A*1101限制性CTL表位对于研发适合中国人群的表位肽疫苗具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽。本专利技术的另一目的在于提供该结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽在制备结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术提供了与HLA-A*1101分子亲和力高，能活化CD8+T细胞、诱导其增殖和分泌IFN-γ的结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为：AVMAGIVRAAK(SEQIDNO.12)(即：Ala-Val-Met-Ala-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Ala-Lys)。本专利技术结合生物信息学预测方法和紫外诱导肽置换实验，利用结核分枝杆菌自身的抗原筛选出具有抗结核活性的表位肽，高效准确地检测出表位肽AVMAGIVRAAK(SEQ ID NO.12)与HLA-A*1101分子之间的亲和力。这是新的、未被报道过的HLA-A*1101限制性结核分枝杆菌表位肽，被结核病人CD8+T细胞广泛识别。由于HLA-A*1101基因型是中国人中最广泛携带的基因型，目前并未发现结核分枝杆菌特异的HLA-A*1101限制性CTL表位肽，本专利技术表位肽的确定，为结核病疫苗、诊断试剂和治疗药物的研发提供了理论基础和新的解决方案，对结核病的防治具有重大意义。附图说明图1为候选表位肽与HLA-A*1101分子亲和力示意图。图2为22条高亲和力的表位肽诱导结核患者T细胞活化并分泌IFN-γ的示意图。图3为ELISPOT检测P12诱导结核患者T细胞分泌IFN-γ的示意图。图4为P12的质谱分析图。图5为CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测P12诱导结核患者CD8+T细胞增殖的结果示意图。具体实施方式本专利技术根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运用CBS数据库中的NetMHCcons表位预测软件对结核分枝杆菌抗原蛋白的HLA-A*1101限制性CTL表位肽进行了预测分析，然后采用紫外诱导肽置换实验检验候选肽与HLA-A*1101分子结合的亲和力和稳定性，筛选获得表位肽，通过体外实验鉴定，CTL表位肽P12可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，并诱导CD8+T细胞发生显著增殖。下面结合具体实施例进一步阐述本
技术实现思路
。应用生物信息学方法，预测HLA-A*1101限制性表位肽：根据文献报道，选取94个有较强免疫原性的结核分枝杆菌抗原蛋白(如表1所示)，从GeneBank获得各个抗原蛋白的氨基酸序列。表1候选结核分枝杆菌抗原蛋白从HLA基因频率数据库AFND(AlleleFrequency NetDatabase,AFND)上获得中国人群HLA-A位点各基因型的频率分布信息，其中HLA-A*1101基因频率约为28％，为HLA-A位点上频率最高的单个基因型。使用生物信息学算法预测抗原蛋白所含的HLA-A*1101限制性CTL表位，采用的算法为CBS数据库中的NetMHCcons。根据IC50值将预测结果进行排序，IC50值越低，说明表位肽与HLA分子亲和力越高。由此，预测出94个抗原蛋白中HLA-A*1101限制性表位肽，并且筛选出其中亲和力最高的50条表位肽，作为候选，如表2所示。表250条HLA-A*1101限制性候选表位肽应用紫外诱导肽置换实验方法，检测候选表位肽与HLA-A*1101分子之间的亲和力和结合稳定性：实验过程如下：含光敏感性表位肽的肽-HLA复合物在紫外线照射下，光敏感性表位肽发生断裂，从HLA分子中脱离，这时往反应体系中加入待检测的候选表位肽，如果候选表位肽和HLA分子亲和力高，则可以形成新的稳定的表位肽-HLA复合物。使用抗-β2m抗体捕获HLA分子，ELISA检测新形成的表位肽-HLA复合物浓度，评价表位肽和HLA分子之间的亲和力大小。共选出与HLA-A*1101具有高亲和力的表位肽(大于100％)22条，见图1和表3所示。表3与HLA-A*1101具有高亲和力的22条表位肽ELISpot实验检测22条表位肽诱导T细胞分泌IFN-γ，初步验证表位肽的免疫效应：实验过程如下：采用密度梯度法分离HLA-A*1101基因型结核患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear本文档来自技高网...
【技术保护点】
结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为： AVMAGIVRAAK（SEQ ID NO.12）。
【技术特征摘要】
1.结核分枝杆菌特异性CD8+T细胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为： AVMAGIVRAAK（SEQ ID NO.12）。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性CD8...
【专利技术属性】
技术研发人员：马骊，刘苏东，罗微，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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