铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列制造技术

本发明专利技术公开了一种具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysterioddehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶。内容包括利用生物信息学分析获得的铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶基因序列；含有铜绿假单胞菌3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA基因序列的重组表达载体；表达3α-羟基类固醇脱氢酶3-hsdA的基因工程菌；3α-羟基类固醇脱氢酶的酶促动力学参数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列，包括其互补链序列。其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶。该蛋白的酶学性质为首次鉴定，具有应用于磺酸化胆汁酸临床检测的实用性，属于生物工程领域。
技术介绍
3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）是广泛存在于哺乳动物细胞和原核细胞中的一类氧化还原酶。细菌3α-HSD是胆汁酸（bile acids，BAs）、磺酸化胆汁酸（sulfated bile acids，SBAs）和雄甾酮等物质定量分析中不可缺少的酶试剂，具有较高的实用价值。磺酸化胆汁酸（sulfated bile acids，SBAs）是体内胆固醇代谢产物胆汁酸（bile acids，BAs）的主要排泄形式之一。在正常生理情况下，体内95%的BAs经肠肝循环（enterohepatic circulation）回到肝胆系统中，少量BAs会随粪便和尿液排出体外。BAs在体内会发生磺酸化作用形成SBAs，这是机体减低BAs的毒性作用和增加BAs溶解性，以利于BAs排泄的一种机制。研究表明，尿中的BAs主要是以磺酸化的形式存在。通常，健康人尿液中SBAs的含量极低。当发生肝胆病变时，由于肝胆结构的破坏，大量BAs便会从肝胆系统中漏出，从而造成尿中SBAs含量异常增高。目前，尿液中SBAs已经被建议作为肝胆疾病早期诊断和治疗监测的重要指标。在日本，尿中SBAs 的含量已经成为肝胆功能评估、肝癌（liver cancer）和肝硬化（hepatocirrhosis）诊断的重要指标。SBAs的定量检测具有很高的临床应用价值。在SBAs的各种测定方法中，酶-比色测定法具有操作简单、准确性较高、测试时间短和设备成本较低等特点，是一种有潜在临床应用价值的检测方法。近年来，本实验室一直致力于开发满足临床应用需求的SBAs测定方法，先后将流动注射分析技术（flow injection analysis，FIA）、固定化酶技术（immobilized enzyme）和化学发光法（chemiluminescence）引入SBAs的酶法测定中，实现了对SBAs的自动分析测定，提高了测定的灵敏度，并建立了一种新型的SBAs生物传感器，开发了尿中SBAs测定试剂盒。这些分析测定技术具有极大的临床应用前景。但是，这些测定方法都需要昂贵的3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）。昂贵的酶试剂是影响这些SBAs检测技术推广应用的主要因素。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发一种新型3α-羟基类固醇脱氢酶，
技术实现思路
如下：1. 提供能产生一种新型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶的基因序列信息（SEQ ID NO:1）。2. 提供一种根据基因信息得到的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列信息。3. 含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶基因的DNA序列的重组表达载体。4. 携带含有铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶基因的DNA序列的重组表达载体的大肠杆菌菌株。5. 得到重组3α-羟基类固醇脱氢酶的酶促反应动力学参数。本专利技术的各种特征如下：1. 通过生物信息学分析发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1基因组中第2356713 bp到2357573 bp碱基基因序列（SEQ ID NO:1）与已知的睾丸酮假单胞菌（P. testosteroni）3-HSD (WP_020684122.1)序列的比对，发现具有51%的同源性，但是功能未知。本研究通过基因工程技术克隆了该段基因；构建了含有该段基因的克隆载体和表达载体；在原核大肠杆菌中进行了诱导表达，并对其酶学性质进行了研究，确认了该基因序列表达的产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性。2. 通过基因重组技术构建了包含特征1所述的基因序列的重组表达载体，方法为：A. 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA原始克隆的大小为1134bp，其聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR）体系如下：混匀后，按照下列反应条件进行PCR反应。于1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片段。 B. 克隆载体pUC19的单酶切3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA使用的克隆载体pUC19大小为2686 bp，用SmaⅠ对pUC19进行单酶切，其酶切反应体系如下：混匀后30°C酶切5 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收pUC19线性片段。C. pUC19线性片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA的 PCR产物的连接将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA PCR产物与pUC19片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下：混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。挑取阳性克隆提取质粒鉴定，获得重组克隆载体pUC19-hsdA。D. 重组克隆载体pUC19-hsdA双酶切用NcoⅠ和EcoRⅠ对重组克隆载体pUC19-hsdA进行双酶切，其酶切反应体系如下： 混匀后，37°C水浴酶切5 h。1%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA片段。 E. pET30b(+)大片段与3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA的连接将3α-羟基类固醇脱氢酶基因3-hsdA与pET30b(+)大片段以1∶3的摩尔比混合，进行连接反应，其连接反应体系如下： 混匀后4℃连接过夜，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基中，培养16-20小时。3. 通过基因工程技术构建的含有特征2所述的重组表达载体的大肠杆菌工程菌，其方法为：取经卡那霉素筛选，pET30b(+)-hsdA重组载体转化后的大肠杆菌BL21(DE3)在培养基中形成的单菌落，接种于含50μg/ml卡那霉素的5mlLB培养液中，37℃下振荡培养过夜；分别取1ml培养液，按天根生化科技（北京）有限公司《质粒小量抽取试剂盒说明书》进行操作提取质粒；.取10μl质粒DNA，加入4μl蒸馏水、2μl缓冲液、2μl 0.1%BSA以及1μl NcoⅠ、1μl EcoR本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有3α‑羟基类固醇脱氢酶（3α‑hydroxysteriod dehydrogenase，3α‑HSD）活性的多肽链的DNA序列（SEQ ID NO:1），包括其互补链序列；其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α‑羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α‑羟基类固醇脱氢酶。

【技术特征摘要】
1.具有3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-hydroxysteriod dehydrogenase，3α-HSD）活性的多肽链的DNA序列（SEQ ID NO:1），包括其互补链序列；其特征在于，该DNA序列的表达产物具有3α-羟基类固醇脱氢酶活性，是一种新型的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3α-羟基类固醇脱氢酶。
2.含有权利要求1所述的DNA序列的原核或真核细胞表达载体；其特征在于，是一种通过D...

【专利技术属性】
技术研发人员：高秀峰，陈建敏，李永生，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51