一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，包括：体外合成单链核苷酸链，并形成DNA双链片段；利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片段，电泳进行鉴定；42229载体用Bbs I进行酶切，线性化后的载体42229和退火延伸后的插入片段通过同源重组的方法进行片段插入，即可。本发明专利技术在多基因位点敲除中简化后续的载体纯化和转染步骤，提高基因敲除的效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于crRNA领域，特别涉及一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法。
技术介绍
1987年，日本课题组在E.coli K12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列(Ishino Y，Shinagawa H，Makino K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene,responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,and identification of the gene produce.J Bacteriol,1987,169(12):5429-5433)，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌和古生菌的基因组中，在2002年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列(CRISPR)(Jansen R,van Embden J D,Gaastra W,et al.Identification of a novel family of sequence repeats among prokaryotes.Omics:a journal of Intearative Biology,2002,6(1):23-33；Mojica F J,Ferrer C,Juez G,et al.Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning.Mol Microbiol,1995,17(1):85-93；Jansen R,Embden J D,Gaastra W,et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.Mol Microbiol,2002,43(6):1565-1575)。CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重复序列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这些间隔区通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和Cas(CRISPR-associated)基因形成CRISPR-Cas适应免疫系统(Horva th,P.and Barrangou,R.(2010)CRISPR/Cas,the immune system of bact eria and archaea.Science 327,167–170；Barrangou,R.et al.(2007)CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science 315,1709–1712；Gasi unas,G.et al.(2013)Molecular mechanisms of CRISPR-mediated microbial immunity.Cel l Mol.Life Sci.http://dx.doi.or g/10.1007/s00018-013-1438-6)。CRISPR/Cas系统的功能是这样行使的：将入侵的核酸片段作为间隔区合并入宿主基因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子(crRNA)，这些crRNA能够和Cas蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉默掉。Type II系统仅仅需要Cas9蛋白就可以用于DNA干扰(Mojica F J,Diez-Villasenor C,Garcia-Martinez J,et al.Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.J Mol Evol,2005,60(2):174-182；Sapranauskas,R.et al.(2011)The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli.Nucleic Acids Res.39,9275–9282；Deltcheva,E.et al.(2011)CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor Rnase III.Nature 471,602–607；Garneau,J.E.et al.(2010)The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.Nature 468,67–71.)。Type II系统进行靶基因的双链断裂的步骤：(i)pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位点被转录下来；(ii)tracrRNA和pre-crRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与Cas9结合，pre-crRNA通过RNase III和某未知核酸酶作用形成成熟的crRNA。该成熟的crRNA中包含有短的间隔序列；(iii)成熟crRNA:tracrRNA杂交双链引导Cas9蛋白到靶DNA位点，DNA靶点需含有protospacer和必需的PAM(protospacer adjacent motif)，这一过程是通过crRNA的间隔序列于protospacer DNA间形成杂化双链来完成；(iv)Cas9蛋白介导靶位DNA中PAM上游进行剪切，在protospacer中进行双链断裂。目前用于构建crRNA，trRNA和Cas9的载体可以分别在Addgene上找到，通过在一个载体上同时表达pre-crRNA和trRNA，与Cas9表达载体共转染小鼠或人来源的细胞，或通过显微注射到哺乳动物细胞的受精卵中，可得到针对特异基因进行敲除的细胞或子代。如果同时转染针对两个或两个以上的基因或染色体位点的crRNA，利用CRISPR/Cas9系统可以同时这些基因或位点进行敲除，但目前，这对同时表达多条crRNA的载体还未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，从而在多基因位点敲除中简化后续的载体纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，包括：(1)体外合成单链核苷酸链，利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片段，电泳鉴定；其中，单链核苷酸链为：insert‑F:GAATGGTCCCAAAACGGGTCTTCGAGAAGACGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGT；insert‑R:GCATAGCTCTAAAACGAAGAGCTCGCTCTTCCGTTTTGGGACCATTCAAAACAGCATAG；(2)42229载体用Bbs I进行酶切，线性化后的载体42229和步骤(1)退火延伸后的双链DNA片段通过同源重组的方法进行片段插入，即可。

【技术特征摘要】
1.一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，包括：
(1)体外合成单链核苷酸链，利用PCR体系，将两条单链核苷酸退火并延伸为双链DNA片
段，电泳鉴定；其中，单链核苷酸链为：
insert-F:
GAATGGTCCCAAAACGGGTCTTCGAGAAGACGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGT；
insert-R:
GCATAGCTCTAAAACGAAGAGCTCGCTCTTCCGTTTTGGGACCATTCAAAACAGCATAG；
(2)42229载体用Bbs I进行酶切，线性化后的载体42229和步骤(1)退火延伸后的双链
DNA片段通过同源重组的方法进行片段插入，即可。
2.如权利要求1所述的一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，其特征在于：所述步
骤(1)中的片段包含19nt两条单链核苷酸链互补配对序列，Bbs I酶切位点，Sap I酶切位点，
15nt和42229 Bsb I酶切位点两端序列同源的序列。
3.如权利要求1所述的一种同时表达两条sgRNA的载体的构建方法，其特征在于：所述步
骤(1)中PCR体系：加ddH2O 10ul，GT Buffer，1.5ul，dNTP 1.5ul，正负...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓倩云，周宇荀，常雪莹，王斯佳，肖君华，李凯，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31