本发明专利技术公开了一种拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，通过序列的合成、克隆载体、目的片段和载体的连接、质粒转化以及重组质粒的提取、冻干保存等步骤制得拉沙热病毒核酸分子特征标准样品，本发明专利技术制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明专利技术提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为拉沙热病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对拉沙热病毒的快速准确检测提供了标准样品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种拉沙热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法，属于分子生物学领域。
技术介绍
拉沙热是一种名为拉沙病毒所引致的急性病毒感染，流行于西非洲的国家∶几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚。病毒的宿主是西非洲的野鼠。拉沙热是经由气雾或直接接触染病的啮齿类动物排泄物而受感染，也可以直接经由病人在发热期传播。人类感染病毒后可以没有病徵，但亦可能病况严重，导至死亡。目前，拉沙热病毒的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检验流程时限缩短，难以保证实验室的质量控制。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术研制一种拉沙热病毒核酸分子特征标准样品，可用于特征序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。本专利技术所述拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要包括如下步骤：1） 合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；2） 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；3） 目的片段和载体的连接反应；4） 通过感受态细菌转化质粒；5） 重组质粒提取；6） 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；7） 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。上述拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒的鉴定：即从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。上述拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。本专利技术所获得的拉沙热病毒核酸分子特征标准样品，即为含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。进一步地，上述步骤2）所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16μL，10X buffer 2μL，EcoRI 1μL，XbaI 1μL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。进一步地，上述步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 μL，合成序列X μL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1μL，10X Ligase solution 1μL，加去离子水补齐至10μL。进一步地，上述步骤4）所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3）得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。本专利技术是基于病毒的RNA序列与cDNA序列互补的原理基础之上，利用DNA合成技术合成病毒的特征核酸序列，将其克隆入质粒载体中，制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本专利技术提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为拉沙热病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对拉沙热病毒的快速准确检测提供了标准样品。附图说明图1质粒酶切电泳图，图2重组质粒测序图，图3序列比对报告。具体实施方式实验材料：pUC19质粒、琼脂糖、限制性内切酶EcoR I和XbaI、T4 Ligase试剂盒、胶纯化试剂盒、DH5α菌株、LB培养基购于大连宝生物工程有限公司，Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System购自promega公司。实施例1：标准样品的制备1．合成序列：利用软件Clone Manager 7.0从GenBank上下载公开发布的序列，进行同源性分析和引物匹配，分析确定拟合成的病毒序列：CGC ACC GGG GAT CCT AGG CAT TTT TGG TTG CGC AAT TCA AGT GTC CTA TTT AAA ATG GGA CAA ATA GTG ACA TTC TTC CAG GAA GTG CCT CAT GTA ATA GAA GAG GTG ATG AAC ATT GTT CTC ATT GCA CTG TCT GTA CTA GCA GTG CTG AAA GGT CTG TAC AAT TTT GCA ACG TGT GGC CTT GTT GGT TTG GTC ACT TTC CTC CTG TTG TGT GGT AGG TCT TGC ACA ACC AGT CTT TAT AAA GGG GTT TAT GAG CTT CAG ACT CTG GAA CTA AAC ATG GAG ACA CTC AAT ATG ACC ATG CCT CTC TCC TGC ACA AAG AAC AAC AGT CAT CAT TAT ATA ATG GTG GGC AA，序列合成委托公司完成；为便于将病毒核酸序列体外转录成RNA，在每段序列前增加一个T7启动子，T7启动子序列20bp：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；2．将合成序列平端克隆入pUC19质粒并通过酶切鉴定及胶纯化：将序列克隆入pUC19质粒中，经序列酶切位点分析，选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，如图1所示，37℃，反应1-2h，反应体系如下：酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，按照Takara公司胶纯化试剂盒说明书进行胶回收纯化；3. 目的片段和载体的连接反应胶纯化后进行连接反应，16℃，反应16h，体系如下：4．感受态细菌的制备挑取冻存的DH5α菌接种于LB培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑单个菌落接种在5mL LB培养基中于37℃ 250rpm振荡培养过夜，转接1mL过夜培养物入100mL LB液体培养基中于37℃培养2-3h，使之进入对数生长期OD600约为0.3，4℃，4,000g离心10mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；2）将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；3）目的片段和载体的连接反应；4）通过感受态细菌转化质粒；5）重组质粒提取；6）采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；7）选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于‑80℃冰箱保存。
【技术特征摘要】
1.拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；
2）将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；
3）目的片段和载体的连接反应；
4）通过感受态细菌转化质粒；
5）重组质粒提取；
6）采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；
7）选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括重组质粒的鉴定：从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。
3.根据权利要求2所述的拉沙热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括核酸序列测定及序列对比分析：将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。
4.由权利要求1所述方法制备的拉沙热病毒核酸分子特征标准样品，即含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。
5.根据权利要求4所述的拉沙热病毒核酸分子特征标准样品，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛芳，李云峰，孙时，吕秀芳，
申请(专利权)人：薛芳，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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