本发明专利技术提供7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法；一种7β-类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：4，编码核苷酸序列为Seq ID NO：3；或所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：6，编码核苷酸序列为Seq ID NO：5。使用高效的7β-类固醇脱氢酶及其突变子酶，以及辅酶再生系统来催化合成胆酸化合物特别是熊去氧胆酸，底物浓度高达100g/L，转化率为99.2-99.5%，重量收率高达94-96%。酶可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及来自于瘤胃菌属（Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属 (Ruminococcusgnavus)的细菌的新的 7β-类固醇脱氢酶（7β-hydroxsteroid dehydrogenase, 7β-HSDH)的突变子、编码这些酶的序列、产生此类酶的方法，及其在胆酸 化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸（UDCA)合成中的用途；此外，本专利技术也包括使 用突变子合成UDCA的新方法，以及UDCA的后提取方法。
技术介绍
： 熊去氧胆酸（I，UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对 映异构体鹅去氧胆酸（II，CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具 有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保 护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相 结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸（CA)或去氧胆酸（如CDCA)。UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所以必须借助酯化 来保护3α-和7α-羟基。此外，7-酮基石胆酸（7-KLCA)的还原用到金属钠或者Pd/C催 化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。PCT/EP2009/002190里描述（如下）使用12α-类固醇脱氢酶（12a-HSDH)选择 性地将胆酸（CA)氧化成12酮-去氧胆酸（12酮-CDCA)，避免了两个保护步骤，但是仍然需 要7-KLCA的还原步骤。胆酸一12-酮-CDCA-CDCA- 7-KLCA-UDCAMonti,D.，等（AdvancedSynthesis&Catalysis2009, 351，1303-1311)描述了另 外一种酶促转化方法。首先通过来自脆弱杆菌ATCC25285的7a-HSDH和12a-HSDH(Tetra hedron, 2006, 62 (18) : 4535-4539)将CA氧化成 7,12-二酮-LCA，然后通过梭菌ATCC27555 的 70-HSDH(BiochimBiophysActa，1981，665(2):262-269)的还原而形成 12-酮-UDCA， 最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要三种酶的参与，以及相关辅 酶的再生系统（乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶），使得整个过程比较复杂。而且因为催化反应 的平衡问题，完全转化是不可能的。CA- 7,12-二酮-LCA- 12-酮-UDCA-UDCAHirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC25986的NADP+依赖性的 7 0_HSDH(ApplEnvironMicrobiol, 1982, 43 (5) :1057-1063),但是没有公开序列信息。 2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年RolfD.Schmid和德国细胞制药公司将此 7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7,12-二酮-LCA或 者 7-KLCA获得 12-酮-UDCA或者UDCA(ApplMicrobiolBiotechnol, 2011，90:127-135)， 发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化 得到了活性提高和去除底物抑制的突变子（CN201080062617,CN201180067680)，重组产生 的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东 理工大学许建和从扭链瘤胃球菌RuminococcustorquesATCC35915克隆并高效表达了其 7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH 相似的、对底物7KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述由不同来源的7β-HSDH催 化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度（4~40g/L)，而且在40g/L的底物浓度下转化 率只有90%，产品收率仅71 % ;-般情况下，酶转化工艺使用100g/L或者更高底物浓度， 且转化率要接近100%，才可视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大 规模生产还有一定的距离。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得来自于瘤胃菌属（Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属 (Ruminococcusgnavus)的新的7β-类固醇脱氢酶（7β-HSDH)的突变子、产生此类重组酶 的发酵方法以及其在胆酸化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸（UDCA)合成中的用 途；本专利技术也包括使用上述酶及突变子合成UDCA的新方法和UDCA的后提取方法。 -种7β_类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列SeqID NO:4,编码核苷酸序列为SeqIDNO:3 ;或所述突变子的氨基酸序列SeqIDNO:6,编码核 苷酸序列为SeqIDNO:5。 所述的的突变子的应用，其特征在于所述的突变子用于催化底物3α-羟基 -7-氧代_5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。 所述的的突变子的应用，其特征在于所述的催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆 烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA的反应，反应中所需要的辅酶由醇脱氢酶催化异丙醇而 合成，从而实现辅酶的循环再生；所述的醇脱氢酶的核苷酸序列为SeqIDN0:7、氨基酸序 列为SeqIDN0:8。 -种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于将采用权利要求1所述的突变子催化底 物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA，同时采用权利要求3所 述的醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。 所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品在有机溶剂 中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品 本专利技术提供的用于UDCA合成的方法示意如下： CA一 7-酮-LCA(7-KLCA) -UDCA 以来源于胆酸的氧化产物（化学法或者酶法）7_KLCA为底物，通过来自于瘤 胃菌属（Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属（Ruminococcusgnavus)的细菌的新的 7β-类固醇脱氢酶（7β-HSDH)的突变子，其将7-KLCA-步直接还原成UDCA，同时使用 Lactobacilluskefir来源的醇脱氢酶/异丙醇体系来实现辅酶NADP+的循环再生（如图 1)。此来源的7β-HSDH突变子能高效地、专一地将高浓度底物7-KLCA转化成UDCA，从而能 实现酶法UDCA合成的工业化生产。 本专利技术的目的是具体通过以下技术方案实现的： 1、来源于活波瘤胃菌属（Ruminococcusgnavus)的新的重组 7β-HSDH(RUHSDH) 的获得 密码子优化的来源于活波瘤胃菌属（Ruminococcusgnavus)的7β-HSDH基 因（GenebankID:WP004843516)被合成后（合成基因序列：SeqIDΝ0:1，编码蛋白序 列：SeqIDΝ0:2)，插入到表达载体pET21a(+)的Ndel和Hindlll位点得到重组DNA pET21a(+)-RUHSDH。经本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种7β‑类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：4，编码核苷酸序列为Seq ID NO：3；或所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：6，编码核苷酸序列为Seq ID NO：5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志斌，刘经辉，吴庆斌，周敦秀，
申请(专利权)人：南京普瑞特生物科技有限公司，刘志斌，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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