一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒及检测方法属检验检疫领域。该试剂盒，包括如下组分：反应混合液、引物混合液、双蒸水、Bst DNA聚合酶、阳性对照模板、显色液、封闭剂。采用上述结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒的检测方法，按照以下步骤进行：(1)模板制备；(2)加样；(3)等温扩增：将上述样品混匀，置于65℃保温50min，冷却至室温；观察颜色变化；(4)阴阳性判断：绿色表示待测样品中存在结核杆菌(阳性)，橙色表示待测样品中不存在结核杆菌(阴性)。本发明专利技术操作简便、用时少、灵敏度高、特异性强，适用于检验检疫部门和卫生医疗单位对结核杆菌的检测，并有望成为简易的常规检测手段,尤其适用于基层单位。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属检验检疫领域，具体涉及一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染病，导致人类感染的结核菌大多数是人型MTB，也有10%左右是牛型MTB。WHO调查报告，仅2008年全球肺结核人数就增加940万，死亡180万。世界卫生组织(WHO)已将结核病作为重点控制的传染病之一。中国在世界上22个结核病高负担国家中排名第二，仅次于印度。我国每年约有13万人死于结核病，如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有5000万的感染者发生结核病。近年来，我系统在对出入境旅行人员的健康筛查中，结核菌感染者比例显著增多，并有持续上升的趋势。许多发达国家对移民、留学和劳务输出人员结核菌的检测尤为重视，已成为签证过程中不可或缺的健康筛查项目。此外，沈阳局保健中心每年受理的朝鲜来华务工人员逐年增加，而目前在朝鲜国内肺结核发病率一直较高，平均每十个人就有三个人患此病，故这类入境人员为结核病的高发人群，所以快速、准确的检测方法是出境人员能够顺利通关、做好入境人员疾病筛查、保护国民健康的关键所在。目前国内对结核分枝杆菌的检测方法大多还是以传统的直接涂片抗酸染色镜检和罗氏培养检查为主。涂片染色镜检法具有简便、快速、成本低等优点，但其敏感性较低，受痰中细菌数量影响较大，且容易受到人为等外界因素的干扰。培养法被认为是结核病病原学诊断的“金标准”，具有精确可靠、特异性高的特点，但其所需时间较长(一般为4?8周)，而且还需要培养箱等设备，并耗费人力资源较多，阳性率较低，严重降低了工作效率，因此在口岸系统的应用价值有限。近年来，核酸扩增技术等分子手段已越来越多地应用于结核分枝杆菌的诊断和检测。其中，以PCR(聚合酶链式反应)技术的应用最为广泛。与上述传统检测手段相比，通过PCR技术对结核分枝杆菌的特异性DNA序列进行基因扩增，可以大大提高结核分枝杆菌的检出率，且特异性很高。但是，由于Real-Time PCR试剂盒成本较高，实时荧光定量PCR仪设备昂贵，并且对人员的操作水平要求较高，使得该技术在许多发展中国家难以普及。更重要的是，应用该技术检测结核杆菌需要至少数个小时的时间，这对于流动性较大的出入境人员群体的结核筛查并不理想。因此，在口岸系统的结核筛查工作中，迫切需要一种既灵敏准确、价格低廉同时又快速及时的检测手段。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)的专利技术为结核病的基因诊断提供了一套强大的工具。LAMP扩增结果可用肉眼直接观测或使用荧光染料方法检测，因其操作简便、成本较低、准确迅速等优点，日益受到大中小型医院及实验室的青睐。LAMP检测结核分枝杆菌复合群是一种新型核酸扩增方法。它的原理是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应，反应只需要把基因模板、引物、链置换DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60?65°C )，经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15分钟?1小时内实现109?1010倍的扩增，报告检测结果。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出结果判断。野外现场检测时，还可以借助染料变色与否通过肉眼判读结果。LAMP的主要特征有：（1)不需要改变温度，使双链DNA先变性成单链，只需要把试剂都加入反应试管中，包括变性步骤的全过程能在等温条件下短时间内完成，可以检测扩增产物或者判定扩增反应发生与否。因此LAMP法是简便、快速的基因扩增法。（2)LAMP法通过4种引物识别6个区段，只针对靶基因进行扩增，是准确的基因扩增法。（3)由于LAMP法不需要特殊试剂、扩增不需要改变反应温度，因此不需特别的温控设备。根据扩增的有无就能测定靶基因是否存在，只需要简单的检测仪器，因此LAMP法可以有效地控制基因检测的成本。（4)LAMP法是简便的基因检测法，可进行实时检测。使用了环引物后，扩增时间更可缩短为原来的1/2到1/3。（5)仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本低廉。（6)扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒及检测方法，本专利技术的具体内容如下。一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒，包括如下组分：反应混合液、弓I物混合液、双蒸水、Bst DNA聚合酶、阳性对照模板、显色液、封闭剂；所述反应混合液的组分及浓度为：40mM Tris-HCl (pH8. 8)，20mMKC1, 20mM(NH4)2S04,体积百分比 0· 2 % 的 Triton X-100，1. 6M 甜菜碱，16mM MgS04, 2. 8mMdNTP ；所述引物混合液的组分及浓度为：内引物FIP和BIP各80pmol，，外引物F3和B3各lOpmol,环引物LB和LF各40pmol ；所述Bst DNA聚合酶为：8U Bst DNA聚合酶；所述阳性对照模板为；根据下列结核分枝杆菌基因靶序列合成的人工质粒；结核杆菌的靶序列为：TCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCGTCCAGCGCCG ；所述显色液为：钙黄绿素。所述试剂盒在-20 V保存。所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3、环引物LB、LF，其LAMP弓|物扩增靶基因为：TB-159F3:TCCACGCCGCCAACTTB-159B3:CGGCGCTGGACGAGATTB-159FIP:TCTGGCCACCTCGATGCCCTTTTCGGTGTTTACGGTGCCCG TB-159BIP:ACGGCTGATGACCAAACTCGGCTTTTGGCTGTGGCCGGATCATB-159LF:TTCAGGGTTAGCCACACTTTGTB-159LB:CAAAGCCCGCAGGACCA。一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测方法，采用上述结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒，按照以下步骤进行:(1)模板制备:(2)加样:取出一个0.2EP管按下面的量以及顺序进行加样:反应混合液12.5 μ 1、引物混合液2.6 μ 1、双蒸水6.9 μ 1、Bst DNA聚合酶1 μ 1、阳性对照模板或样本DNA 2 μ 1、显色液1μ 1、封闭剂一个；总反应体系为26 μ 1 ;(3)等温扩增:将上述样品混匀，置于65°C保温50min，冷却至室温；观察颜色变化；(4)阴阳性判断:绿色表示待测样品中存在结核杆菌(阳性)，橙色表示待测样品中不存在结核杆菌(阴性)。所述模板制备按照以下步骤进行:l)TritonX-100 裂解液制备:10mmol/L Tris_HCL，0.lmmo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核杆菌LAMP法恒温快速检测试剂盒，其特征在于包括如下组分：反应混合液、引物混合液、双蒸水、Bst DNA聚合酶、阳性对照模板、显色液、封闭剂；所述反应混合液的组分及浓度为：40mM Tris‑HCl(pH8.8)，20mM KCl,20mM(NH4)2SO4，体积百分比0.2％的Triton X‑100，1.6M甜菜碱,16mM MgSO4,2.8mM dNTP；所述引物混合液的组分为：内引物FIP和BIP各80pmol,，外引物F3和B3各10pmol，环引物LB和LF各40pmol；所述Bst DNA聚合酶为：8U Bst DNA聚合酶；所述阳性对照模板根据下列结核分枝杆菌基因靶序列合成的人工质粒；结核杆菌的靶序列为：TCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCGCTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCGTCCAGCGCCG；所述显色液为：钙黄绿素。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张波，罗力涵，陈钰，李莎，毕秀欣，王嬙，
申请(专利权)人：沈阳国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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