一种核酸扩增反应混合物颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸扩增反应混合物，由核酸扩增反应混合液经过冷冻干燥形成，呈冻干颗粒状，其含水量为0.1～3％；核酸扩增反应混合液至少含有核酸扩增反应的必需成分和冻干保护剂；其中，冻干保护剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、葡聚糖、聚蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠中的一种或几种的混合物，冻干保护剂与核酸扩增反应混合液的重量体积比浓度为5％～20％。该核酸扩增反应混合物冻干颗粒形态致密结实、外表光滑，显微放大状态下观察可见其含有细小孔径，该冻干颗粒可以在室温下保存一年以上而反应活性保持不变，甚至在40～45℃下也不会丢失生物反应活性，使用时加入复溶液可迅速溶解，恢复反应活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸扩增反应领域，尤其涉及一种在室温下可长期保存且易溶的核酸 扩增反应混合物颗粒及其应用。
技术介绍
核酸扩增反应体系中的很多成份在相对高温的条件下都不稳定，如核酸聚合酶、 引物、dNTP等，均需要在冷藏的条件下，比如低于_20°C下保存。这些反应成份一般单独的 或者以部分混合的方式存放在低温条件下，但即使冷冻条件也并不能长期保持这些成份的 生物活性，且使用时需要很长时间解冻，或者在冰盒上进行分装，试剂的反复冻融会进一步 影响有效成分的生物活性。而且，长期冷冻保存需要消耗大量的能源，增加了运输和储存成 本。 申请号为"200810159414. 3 "的中国专利申请公开了一种环介导等温扩增反应 试剂混合物的保存方法，该方法在环介导等温扩增反应试剂混合物中加入特定的干燥保护 剂，然后将添加了干燥保护剂的环介导等温扩增反应试剂混合物在低于80°C的条件下进行 真空干燥或快速风干，实现了环介导等温扩增反应试剂混合物在常温或室温条件下的长期 保存。该方法存在的缺点是：由于加工过程中温度过高，会使核酸聚合酶活性丢失，而且所 得的环介导等温扩增反应试剂混合物常温保存的时间也较短，同时，所得的环介导等温扩 增反应试剂混合物不能在过高的温度下存放。 另外，以上两个专利提到的方法加工后的产物为致密状的半固体，当用来进行核 酸扩增反应时，加水后，不易短时间内完全溶解，影响了试验操作效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有的核酸扩增反应试剂常温保存时间较短其有效成分 易失活的问题，以及解决核酸扩增反应试剂的加工产物使用时，不易短时间内完全溶解，影 响试验操作效率的问题。 因此，本专利技术提供了一种核酸扩增反应混合物，所述核酸扩增反应混合物由核酸 扩增反应混合液经过冷冻干燥形成，呈冻干颗粒状，其含水量为〇. 1~3% ;所述核酸扩增 反应混合液至少含有核酸扩增反应的必需成分和冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂为蔗 糖、海藻糖、葡萄糖、葡聚糖、聚蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、 羧甲基纤维素钠中的中的一种或几种的混合物，且所述冻干保护剂与所述核酸扩增反应混 合液的重量体积比浓度为5 %~20 %。 在上述技术方案中，冻干保护剂能够减少冷冻干燥过程中对核酸扩增反应必需成 分的损害，保持冻干颗粒在高温下的反应活性，使得核酸扩增反应混合物能够在室温下长 期储存。 在上述技术方案中，冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的温度（一 10°C~一 50°C)下冻结成固态，然后在真空（1. 3~13帕）下使其中的水分不经液态直接升华成气 态，最终使物料脱水的干燥技术。在冷冻干燥过程中，核酸扩增反应的必需成分的结构不会 发生破坏，因为固体成分被在其位置上的坚冰支持着，在冰升华时会留下空隙在干燥的剩 余物质里，这样就保留了核酸扩增反应的必需成分的生物和化学结构及其活性的完整性； 而且，冷冻干燥过程是在低温状态下进行的，该工艺过程对组分的破坏程度小，热畸变极其 微弱，不会造成核酸聚合酶等的生物活性降低；同时，制得的冻干颗粒为多孔结构，较脆，复 水性能好，能够迅速完全重复再溶解，加快核酸扩增反应的操作效率；且冻干物干燥前后形 状及体积不变化，干燥后真空密封或充氮密封，消除了外界对冻干颗粒的影响。冷冻干燥能 排除97%以上的水分，使得冻干颗粒的含水量在3%以下，较低的含水量能够提高核酸扩 增反应用冷冻颗粒的最高忍受温度，并能延长冻干颗粒的保存时间。 在上述技术方案中，所述冻干保护剂与所述核酸扩增反应混合液的重量体积比浓 度为5%~20% (w/v)。重量体积比浓度即100ml溶液中所含溶质的克数。当冻干保护剂 浓度过低时，会影响冻干产品的物理外观，所得的冻干颗粒不结实，易碎；当冻干保护剂浓 度太高，溶质浓度增加，阻碍升华，影响冻干效率，并且过高的保护剂对核酸扩增反应有一 定的影响。 在上述技术方案中，核酸扩增反应必需成分可能不包括核酸扩增反应体系所需的 所有组分，只含有其中几种需低温保存的组分，或者是几种需低温保存的组分与可常温保 存组分的混合物。需低温保存的组分通常为引物、核酸聚合酶、dNTPs、核酸荧光染料、核酸 扩增反应缓冲液（buffer)，前四者通常在-20°C保存，buffer可在4°C保存。以环介导等温 扩增反应（LAMP)为例，一般的环介导等温扩增反应体系包括LAMP引物、dNTPs、具有链置换 功能性的核酸聚合酶、buffer，在进行环介导等温扩增反应用冻干颗粒的制备时，所用扩增 反应试剂可以仅含LAMP引物、dNTPs或具有链置换功能性的核酸聚合酶，也可以进一步含 有核酸荧光染料和buffer。 作为对上述技术方案的进一步改进，所述冷冻干燥处理包括以下步骤： (1)控制温度为_50°C~_40°C，压强为latm，维持10~40min; (2)控制温度为_50°C~_40°C，压强为2~2. 4pa，维持8~12h; (3)控制温度为_5°C~5°C，压强为2~2.4pa，维持2~4h ; (4)控制温度为20°C~25°C，压强为2~2.4pa，维持4~6h，即完成所述冷冻干 燥处理。 其中，所述步骤（1)为预冻阶段，所述步骤（2)~（4)为真空干燥阶段，其中步骤 (2)为升华干燥阶段，步骤（3)和步骤（4)为解吸干燥阶段。 在上述技术方案中，预冻是定形的过程，它可赋予干燥产品与干燥前具有相同的 形态，同时防止真空干燥时物料表面的收缩，而预冻过程水结成冰所产生的机械效应和溶 质效应是引起核酸扩增反应用试剂失去活性的一个重要因素，预冻时降温速度、温度和时 间可直接影响干燥速率和冻干颗粒的质量，为了确保冻干颗粒较好的复水性，防止溶质浓 缩引起的核酸扩增反应试剂活性的丢失，尽可能提高升华速度，同时确保抽真空前核酸扩 增反应混合液体试剂已被冻实。在本专利技术中预冻温度为在-50~_40°C，保持时间为10~ 40min〇在上述技术方案中，真空冷冻干燥的初次干燥的过程就是升华的过程，通过升华 干燥将核酸扩增反应混合液中冻结的自由水升华逸出。为了达到较快的干燥速度，同时防 止核酸扩增反应混合液熔化、变性或崩塌，初次干燥的温度设定为-50~-40°C。初次干燥 过程中，合适的压强有利于热量的传递和升华的进行，本专利技术中压强控制在2~2. 4pa，若 压强过低，则对传热不利，核酸扩增反应混合物不易获得热量，升华速率低，同时也会增加 成本；压强过高时，冰的升华速度减慢，核酸扩增反应混合物自身温度会上升，当高于共熔 点温度时，核酸扩增反应混合物将发生熔化而导致冻干失败。 在上述技术方案中，二次干燥主要是去除部分结合水，这部分水主要由范德华力、 氢键等弱分子键吸附在核酸扩增反应组合试剂上，需要更多的能量才能将其去除，为了不 破坏核酸扩增反应混合物的生物活性，本专利技术将温度设定为_5°C~5°C，控制压强为2~ 2. 4pa，保持2~4h，接着将温度升至20~25°C，控制压强2~2. 4pa，保持4~6h。 作为对上述技术方案的更进一步改进，所述冷冻干燥处理包括以下步骤： (1)控制温度为-45°C，压强为latm，维持25min;(2)控制温度为-45°C，压强为2. 2pa，维持10h ;(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增反应混合物，其特征在于：所述核酸扩增反应混合物由核酸扩增反应混合液经过冷冻干燥形成，呈冻干颗粒状，其含水量为0.1～3％；所述核酸扩增反应混合液至少含有核酸扩增反应的必需成分和冻干保护剂；其中，所述冻干保护剂为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、葡聚糖、聚蔗糖、牛血清白蛋白、胶原蛋白、聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠中的中的一种或几种的混合物，且所述冻干保护剂与所述核酸扩增反应混合液的重量体积比浓度为5％～20％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄昱阳，杜正平，熊槐，谭慧媚，曹以诚，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44