本发明专利技术涉及一种用于定量检测TRECs和KRECs基因实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。本发明专利技术包括一个以实时荧光PCR技术为基础的实时荧光定量(Real time)PCR反应体系。荧光PCR反应体系包括针对TRECs、KRECs和β-actin基因的正、反向引物和特异性荧光探针。该试剂盒可以快速地联合筛查新生儿免疫系统T细胞水平和B细胞水平，具有高灵敏度和稳定性，以及非常好的重现性，此方法适用于TRECs和KRECs的联合定量检测，能应用于新生儿免疫系统功能筛查，具有实际的临床应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸诊断领域，涉及一种一步法定量检测游离T细胞受体切除 环（T-cellreceptorexcisioncircles，TRECs)和κ-删除重组切除环（k-deleting recombinationexcisioncircles,KRECs)基因的实时焚光定量聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction，PCR)试剂盒及其应用。
技术介绍
原发性免疫缺陷病（PrimaryImmunodeficiencyDisease，PID)是一类因免疫 系统遗传缺陷或先天发育不全造成免疫功能障碍所致的免疫缺陷病，已发现超过200个病 种。PID常发生在婴幼儿期，可出现反复感染，严重的可威胁生命。其中有些可能获得有效的 治疗，因此及时诊断仍很重要。2008年美国CDC在美国威斯康辛州进行重症联合免疫缺陷 (SevereCombinedImmunodeficiencyDisease,SCID)新生儿筛查。从2009年起，美国马萨 诸塞州、路易斯安那州、纽约州、加利福利亚州、德克萨斯州、宾夕法尼亚州、密歇根州以及 波多黎各自由邦等陆续开展新生儿SCID筛查，已有超过21个州进行了新生儿SCID筛查。 在世界范围内，有美国、瑞典、德国、英国、法国、土耳其、日本、沙特阿拉伯、伊朗、中国香港 等多个国家和地区已开展PID筛查。其总发病率为：美国1/10000,澳大利亚2. 82/100000， 日本和瑞典1/5000,我国香港地区1/8000。目前国内缺乏全面的统计资料，如果按照相关 研究得出的PID总发病率1/10000估算，我国每年出生的2500万个新生儿中有2500个新 发的PID病例，整个儿童期累及病例达到3万-6万例。 按免疫缺陷性质的不同，原发性免疫缺陷病可分为特异性和非特异性两大类，其 中特异性PID占到80%的比例。特异性PID包括体液免疫缺陷（即抗体缺乏为主的免疫缺 陷）、细胞免疫缺陷以及两者兼有的联合性免疫缺陷三大类。非特异性PID有补体缺陷、吞 噬细胞缺陷等。SCID是以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数 量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，新生儿发病率大约在1/50000至1/100000,该病发 病年龄早，临床表现重，预后较差，如果没有得到及时的诊断和治疗，多在2岁内死亡。SCID 是一种严重的联合免疫缺陷，患儿如果不进行有效的免疫重建，往往在婴儿期死亡，免疫重 建的时间与预后的关系密切，如果在出生3个月内进行造血干细胞移植，存活率接近95%， 而3个月后进行造血干细胞移植存活率降低至76%，然而，SCID患儿因携带了母亲的抗体 使得其在出生的最初几个月看上去是正常的，直到大约6个月时因出现反复感染才显出异 常，因此将SCID纳入新生儿筛查非常必要。 目前，SCID主要分为T-B+SCID和T-B-SCID两大类。其中T-B+SCID的致病原因有 yc基因缺陷、JAK3(JanusKinase3)基因缺陷、IL-7Ra基因缺陷、CD45基因缺陷、0)3δ/ ⑶3ε/⑶3ζ基因缺陷、Coronin-IA基因缺陷；T-B-SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、 DCLRE1C基因缺陷、ADA基因缺陷、DNAPKcs基因缺陷、网状组织发育不全。此外，SCID还包 括Omenn综合征、DNA连接酶VI、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配体缺陷、嘌呤核苷酸磷酸化酶 (PNP)缺陷、CD3γ缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHCI类分子缺陷、MHCII类分子缺陷、钙 离子通道缺陷等。导致SCID的原因繁多，诊断非常困难，但是所有SCID的共同特征是成熟 T细胞的数量显著降低。 T细胞在胸腺分化的过程是发生在T细胞受体基因的重排的时候，最终是V、D和J 基因片段的结合；在每个V、D和J基因片段重排的过程中，都会有被切除的环状DNA产物， 被切割下来的DNA形成游离T细胞受体切除环（TRECs)，70%表达αβTCRs的T细胞在成 熟晚期都产生δRec-(})JaTREC。TRECs在T细胞中非常稳定，并不伴随细胞的增殖而增加， 而是不断被稀释，新生儿TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明显降低。利用 定量PCR检测δRec-φJaTREC可以反映外周血最新产生的T淋巴细胞数量，病人T细胞中 TRECs缺乏或不同程度的减少，可以作为SCID的筛查方法，筛查出T细胞成熟缺陷的新生 儿，有利于早诊断早治疗，减少新生儿死亡。 抗体缺乏为主的免疫缺陷病属于细胞免疫缺陷类，是由于B细胞早期发育障碍 引起的一组原发性免疫缺陷症，由于体液免疫缺陷，容易反复发生细菌感染，表现为B细 胞和免疫球蛋白不同程度的减少，是发病率最高的原发性免疫缺陷病。目前分为以下几 类：1)严重低丙球蛋白血症，致病原因有BTK基因缺陷、μ链缺乏、λ5链缺乏、Iga缺乏、 Igi3缺乏、B细胞连接蛋白（BLNK)缺乏、骨髓发育不良等，其中X连锁无丙种球蛋白血症 (XLA)是最常见的体液免疫缺陷症，其病因是Bruton酪氨酸激酶（Bruton'sTyrosine Kinase，BTK)缺陷，表现为B细胞和免疫球蛋白显著低下；2)血清IgG和IgA的重度减少 伴B细胞正常、减少或显著减少，致病原因有普通变异型免疫缺陷病（CommonVariable ImmunodeficiencyDisease，CVID)、可诱导共刺激分子（InducibleCo_Stimulator，IC0S) 缺陷、⑶19缺陷、X连锁淋巴组织增殖综合症（X-linkedLymphProliferativeDisease， XLP) ;3)血清IgG和IgA的重度减少，IgM正常或增高（高IgM综合症），致病原因有⑶40 配体缺陷、0)40缺陷、活化诱导胞啶脱氨基酶（Activation-inducedCytidineDeaminase， AICDA)缺陷、尿嘧啶N-糖基化酶（Uracil-N-Glycosylase，UNG)缺陷；4)同种型或轻链缺 乏，致病原因有Ig重链缺乏、κ链缺乏、选择性IgG亚类缺陷、选择性IgA缺陷等。抗体缺 乏为主的免疫缺陷病病因繁多，诊断非常困难，但共同特征是B淋巴细胞缺乏或不同程度 的减少。 在B细胞成熟过程中，免疫球蛋白的λ链发生的基因重排时形成的κ-删除重组 切除环（K-deletingrecombinationexcisioncircles，KRECs)，KRECs也不随着细胞的 增殖而增加，而是不断被稀释。因为抗体缺乏为主的免疫缺陷病中的B细胞成熟缺陷发生 在κ-删除重组前，病人B细胞中KRECs缺乏或不同程度的减少，利用定量PCR法检测KRECs 可以作为抗体缺乏为主的免疫缺陷病的新生儿筛查方法，因此通过对KRECs的定量测定可 以筛查出患有B细胞成熟缺陷的新生儿。 联合筛查新生儿原发性T细胞及B细胞免疫缺陷，能够检测新生儿T细胞和B细 胞水平，不仅可以筛查SCID及抗体缺陷为主的免疫缺陷病，而且能够为其他与T细胞和B 细胞发育有关的原发性免疫缺陷病或其他系统疾病提供临床相关指征，有利于早期诊断及 治疗。 申请号为2012104本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种一步法定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒，其中包括DNA提取液、包含TRECs基因插入序列的标准品I、包含KRECs基因插入序列的标准品II、包含β‑actin基因插入序列的标准品III、包含TRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液I、包含KRECs基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液II和包含β‑actin基因的实时荧光引物和探针的荧光PCR反应液III。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓川，王牧，李芳序，刘丹如，
申请(专利权)人：上海领检科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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