一种用于检测PRRSV欧洲株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包含One Step RT-PCR buffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，所述使用方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本试剂盒省时、省力，成本较低，具有高度特异，敏感和简单等特点，能快速、敏感、准确以及低成本地对猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒进行检测及定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猪繁殖与呼吸综合征
，具体说是一种用于检测猪繁殖与呼吸 综合征欧洲株病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本专利技术还包括该试剂盒的使用方 法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS) 自二十世纪八十年代末期开始流行，1992年国际兽医局正式命名，主要感染猪，尤其是母 猪，该病严重影响其生殖功能，临床主要特征为流产，产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难，仔 猪死亡率高、感染猪出现免疫抑制等现象，因在发病过程中出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故 又称为蓝耳病。 最早关于PRRSV起源的假说是PeterG.W、经过大量的实验研究后提出的，他认为 PRRSV可能起源于LDV(鼠乳酸脱氢酶病毒），LDV通过口服或伤口途径野家鼠传播至欧亚 野猪，在野猪体内逐渐生存下来并进行繁殖变成适应性宿主。随着美国引进野猪最先将病 毒传播至北卡罗来纳州并生存下来，从此病毒就在欧洲和北美进行各自独立的变异、进化。 经过约70年变异、进化，并从野猪群传到了家猪群，也形成了目前的美洲型和欧洲型。与所 有的RNA病毒一样，PRRSV具有高度的变异性，易形成一个异源的种群，因其基因序列及抗 原性的差异，目前PRRSV被分为欧洲株和美洲株。 目前，国内外就PRRSV的检测方法而言，已有复合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方 法，荧光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能检测是否PRRSV感染，无法区 分哪种毒株感染引起，国内也没有针对欧洲株的检测方法，国外检测试剂检测一份样品的 价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高使业主无法接受。所以导致接种疫苗存在 很大盲目性，进而导致人们预防和监测PRRS的难度加大。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于检测欧洲株PRRSV的技 术手段的难题，提供一种能够快速、敏感、准确以及低成本的用于检测猪繁殖与呼吸综合征 病毒欧洲株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本专利技术还提供该试剂盒的使用方法，本试 剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒。 为解决上述问题，本专利技术采用了下述技术方案： -种用于检测猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂 盒，包括OneSt印RT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDNO: 1和 SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探针引物的混合物。 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:2引物混合物的包括： SEQIDN0:1 :上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT;SEQIDNO: 2:下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC。 探针引物序列为： SEQ ID N0:3 :GCCGGCCTGAAGCAACTGGTGG。 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。 SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列：SEQIDN0:4(273bp)： 所述阴性对照为无RNA/DNA酶水。 所述阳性对照为含有PRRSV欧洲株基因序列的阳性质粒pGM-273,其构建方式如 下： a.PRRSV欧洲株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操作。 以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为引物 扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，52°C退火40s，72°C延伸50s，共30个循 环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。 b.PCR产物的克隆及序列分析 PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列 测定正确的质粒命名pGM-273,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为 367ng/ul，计算出其拷贝数为1. 17X10n(C〇pies/Ul，拷贝数/微升），本专利技术的试剂盒利用 1. 17xl06(C〇pies/ul)浓度的质粒作为阳性对照以及利用其倍比稀释后制作为标准曲线。 本专利技术还提供了所述试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征欧洲株病毒时的使用 方法，包括以下步骤：a.使用本检测试剂盒进行RT-PCR扩增，扩增条件如下：42°C反转录5min;94°C预 变性 2min;94°C20s，退火温度 52°C30s，72°C20s，40 个循环；b.结果分析 根据扩增结果判定，判定标准为：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性； Ct值介于35-40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴 性；也可以依扩增得到的Ct值根据标准曲线对样品进行准确定量。 上述使用本试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR的反应体系如下：a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；b.弓丨物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液3份，其中273bp上游引物1份， 273bp下游引物1份，探针引物1份；c.酶混合物1份；d.无RNA/DNA酶水 5· 5 份； e.提取样品的RNA模板3份； f.阳性对照pGM-273阳性质粒3份； g.阴性对照无DNA酶水3份。 本专利技术针对欧洲型毒株基因特点设计了针对PRRSV欧洲株的检测引物及探针，建 立了TaqmanReal-timeRT-PCR(探针法实时定量反转录-聚合酶链反应）检测方法，优化 并组装成试剂盒，弥补了PRRSV欧洲株检测技术上的欠缺。本专利技术的试剂盒在使用过程中 将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，省时、省力，成本较低，检测时间由原来的4-5 小时缩短到现在的1-2小时，从而有利于快速检测。同时本专利技术使用了探针法，使该方法与 普通PCR方法相比具有更高的准确性，对模板浓度要求较低，可用于检测低微含量的蓝耳 病病毒；可以看到整个扩增过程、扩增效率、溶解温度，利用已知起始拷贝数的标准品直接 得到标准曲线。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始 拷贝数，进行精确定量。本试剂盒具有高度特异，敏感和简单等特点，有助于PRRSV欧洲株 的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。另外，相比国外试剂盒，具有价格 优势。本专利技术试剂盒及其使用方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中 小型养殖场等，具有较好的应用前景。【附图说明】 图1.为本专利技术制作的标准曲线。 图2.为本专利技术样本检测图。 图1中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术进行进一步详细叙述 实施例1 1、引物的设计和制备 参照GenBank(基因库）查找十株毒株，经序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测PRRSV欧洲株的Taqman Real‑time RT‑PCR试剂盒，包括One Step RT‑PCR buffer 、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，其特征在于：所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物序列为：SEQ ID NO:1：上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT；SEQ ID NO:2：下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴锦艳，田宏，尚佑军，陈妍，王光祥，刘湘涛，张志东，栾志舫，臧金凤，王耀杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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