本发明专利技术涉及一种华法林药物基因突变位点检测的试剂盒，所述试剂盒包括PCR混合反应液、引物探针mix、酶mix，以及阳性对照品。与现有技术相比，本发明专利技术的有益效果为：采用等位基因特异性MGB探针对SNP位点进行扩增检测，设计简单，操作方便，灵敏度高，结果易判读。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术及临床分子诊断领域，尤其涉及一种华法林药物基因突变位 点检测的试剂盒及检测方法。
技术介绍
华法林（warfarin)是目前临床上广泛使用的维生素K拮抗剂类口服抗凝血药，通 过干扰环氧化型维生素K与氢醌型维生素K之间的转化循环而产生抗凝效益，常用于静脉 血栓栓塞、心肌梗死、缺血性脑卒中、心脏瓣膜置换术后、房颤等的抗凝治疗和预防。由于华 法林治疗窗口较窄，在临床使用过程中，不同个体间的稳定治疗剂量不尽相同，如果给药量 不足会导致血栓形成，给药量过大将会增加出血风险，甚至危及生命。因此，为不同个体选 择合适的抗凝方案，已成为心脏术后患者远期疗效重要的影响因素之一。 研究表明，华法林的用药剂量除了受患者年龄、性别、体重、体表面积、营养状态、 肝肾功能、饮食及使用药物等临床因素的影响外，华法林的靶酶VK0RC1和用药剂量酶 CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素。 在药效学方面，华法林通过抑制VK0RC1的活性，阻碍维生素K由环氧化物转化成 氢醌，从而阻断凝血因子II、VE、IX、X及抗凝蛋白C和S的活化达到抗凝的目的。大量研究 发现，在VK0RC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，其中VK0RC1启动子的基因多态 性（_1639G>A)和内含子区域1173CXT基因多态性是影响华法林需求剂量中种族差异和个 体差异的最主要因素。当VK0RC1基因突变后转录活性下降，抗华法林的能力降低，从而在 药物效应动力学方面影响华法林的作用。 在药代动力学方面，华法林是由R-和S-对映体组成的外消旋混合物，在肝脏中经 细胞色素酶P450代谢为非活性产物。其中S-华法林拮抗维生素K的能力是R-华法林的 3~5倍，在稳定状态下，S-华法林能够发挥60 %~70 %的抗凝作用，并主要经CYP2C9酶代 谢。CYP2C9是CYP系统的亚家族，该酶基因位于染色体10q24. 2上，全长约55kb，含有8个 内含子和9个外显子，编码490个氨基酸，分子量为55kd的蛋白质。CYP2C9基因编码区存在 着单核苷酸多态性，与亚洲人群最为密切的是CYP2C9*2 (430OT)和CYP2C9*3 (1075A>C)。 研究表明，具有这两种突变的个体所需华法林剂量明显降低，出血的风险也随之增加。因此 研究基因多态性与华法林剂量需求的关系，指导个体化用药，具有重要的临床意义。 目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分 析法（PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线（HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测 序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序 法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读复杂，对操作者 要求较高，难以形成商业化的诊断产品。限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低， 而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶 解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速 的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性、假阴性较 高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准 确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。 荧光定量PCR法是分子诊断领域应用最广泛的一种检测手段，该方法灵敏度高、 操作简便，适合大规模的临床应用，特别是ABI公司的MGB探针技术在单核苷酸分型方面更 是具有广阔的市场。MGB探针上的小沟结合物能够提高探针的Tm值，设计的比普通Taqman 探针短，无背景荧光，而且具有能分辨一个碱基差异的能力，非常适合用于SNP分型检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测VK0RC1和CYP2C9基因SNP位点的试剂盒及 检测方法。 本专利技术提供的试剂盒包括：PCR混合反应液、引物探针mix、酶mix，以及阳性对照 品。本专利技术所述的PCR混合反应液中包括PCRBuffer、MgC12、dNTPs。本专利技术所述的酶mix 包括UNG酶、TaqDNA聚合酶。本专利技术所述的引物探针mix包括检测基因VK0RC1 (_1639G>A) SNP位点的引物及特异性MGB探针，或检测基因VK0RC1 (1173C>T)SNP位点的引物及特异性 MGB探针，或检测基因CYP2C9*2 (430C>T)SNP位点的引物及特异性MGB探针，或检测基因 CYP2C9*3 (1075A>C)SNP位点的引物及特异性MGB探针；或检测内参基因GAPDH的引物和探 针；本专利技术所述的阳性对照品包括VK0RC1 (_1639G>A)SNP位点野生型、突变型质粒DNA及内 参质粒DNA的混合物；或者VK0RC1 (1173C>T)SNP位点野生型、突变型质粒DNA及内参质粒 DNA的混合物；或者CYP2C9*2 (430OT)SNP位点野生型、突变型质粒DNA及内参质粒DNA的 混合物；或者CYP2C9*3 (1075A>C)SNP位点野生型、突变型质粒DNA及内参质粒DNA的混合 物。 本专利技术提供的试剂盒可以在4管内完成VK0RC1基因及CYP2C9基因共4个SNP位 点的检测，操作简便，灵敏度高。其中反应管A检测VK0RC1基因-1639G>A多态性，反应管 B检测VK0RC1基因11730T多态性，反应管C检测CYP2C9*2 (430OT)基因多态性，反应管 D检测CYP2C9*3(1075A>C)基因多态性。 本专利技术提供的试剂盒针对各基因的SNP位点设计等位基因特异性MGB探针、通用 上游引物和通用下游引物，所述特异性MGB探针优选在5'端连接有荧光发光基团，3'端连 接有荧光淬灭基团。所述的荧光发光基团为FAM或VIC，所述的荧光淬灭基团为MGB。具 体地，所述的检测VK0RC1基因-1639G>ASNP位点的上游引物、下游引物、野生型探针、突 变型探针序列如SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示；所述的检测 VK0RC1基因1173C>TSNP位点的上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针序列如SEQ IDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示；所述的检测CYP2C9*2(430C>T)SNP 位点的上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针序列如SEQIDN0:9、SEQIDNO: 10、 SEQIDN0:11、SEQIDN0:12所示；所述的检测CYP2C9*3(1075A>C)SNP位点的上游引物、下 游引物、野生型探针、突变型探针序列如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQ IDNO: 16所示。具体序列如下： 本专利技术提供的试剂盒还用管家基因GAPDH作为内对照。所述内标探针为Taqman探 针，优选在5'端连接有荧光发光基团，3'端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发光基团为R0X，所述的荧光淬灭基团本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种华法林药物基因突变位点检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR混合反应液、引物探针mix、酶mix，以及阳性对照品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴舒歌，郜恒骏，段本松，张小燕，牟晓庆，
申请(专利权)人：上海芯超生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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