一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法，属于细胞生物学检测领域。该方法包括：将待检测细胞接种到亲水支架上进行培养，至待检测细胞在亲水支架上的生长融合率为90％-95％时，获得支架-细胞复合体系。采用吖啶橙染色液对支架-细胞复合体系进行荧光染色，并采用磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤。将洗涤后的支架-细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观察，从而检测得到亲水支架上细胞的培养状态。本发明专利技术实施例提供的方法能够清晰、准确地检测亲水支架上细胞的分布情况及生长状态，且操作简便，便于规模化推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞生物学检测领域，特别涉及。
技术介绍
组织工程支架是一种用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物，它可以为细胞的生长输送营养及排泄代谢产物，并为细胞的增殖和分化提供结构支撑和空间。为了获知组织工程支架的作用效果，在利用组织工程支架进行细胞培养时，需要对组织工程支架上所培养细胞的分布、生长和增殖等培养状态进行检测。因此，有必要提供一种简单易行、清晰准确的检测组织工程支架上细胞培养状态的方法。目前，现有技术通常采用荧光染料对细胞中的某些特定成分(如DNA、RNA等)进行标记，通过激光扫描共聚焦显微镜对细胞中荧光标记的特定成分发出的荧光进行观测，从而了解细胞在组织工程支架上分布、生长和增殖情况。专利技术人发现现有技术至少存在以下问题:当组织工程支架为亲水性时，其非特异性吸附荧光染料，造成亲水性组织工程支架(以下简称亲水支架)也会发出荧光，这与细胞自身发出的荧光产生重叠，从而对亲水支架上细胞培养的检测造成干扰，使其检测结果不准确。
技术实现思路
为了解决现有技术中检测亲水支架上的细胞培养状态时容易受到荧光染色液的干扰，以致检测结果不准确的问题，本专利技术实施例提供了一种准确可靠地检测亲水支架上细胞培养状态的方法。具体技术方案如下:本专利技术实施例提供了，所述方法包括:步骤a、将待检测细胞接种到亲水支架上进行培养，至所述待检测细胞在所述亲水支架上的生长融合率为90 % -95 %时，获得支架-细胞复合体系。步骤b、采用吖啶橙染色液对所述支架-细胞复合体系进行荧光染色，并采用磷酸缓冲盐溶液对染色后的所述支架-细胞复合体系进行洗涤。步骤c、将洗涤后的所述支架-细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观察，从而检测得到所述亲水支架上细胞的培养状态。具体地，作为优选，所述绿色荧光通道使用的激发光的波长为515-545nm，所述橙色荧光通道使用的激发光的波长为590-620nm。具体地，作为优选，采用所述激光扫描共聚焦显微镜进行观察的过程中，沿Z轴方向每隔0.8-1.2 μπι对所述支架-细胞复合体系进行一次断层扫描，待断层扫描完成后，将全部断层扫描图像按Ζ轴方向上的顺序叠加，获得所述待检测细胞在所述亲水支架上三维状态。具体地，作为优选，所述亲水支架为魔芋葡甘聚糖微球支架。具体地，作为优选，所述吖啶橙染色液为浓度为0.8-1.2mg/ml的吖啶橙乙醇溶液。具体地，作为优选，将所述待检测细胞接种到所述亲水支架上进行培养时，接种密度为1.8X 105-2.2X 105个细胞/毫升。具体地，作为优选，采用所述磷酸缓冲盐溶液对所述染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤的次数为1-4次。具体地，作为优选，采用所述激光扫描共聚焦显微镜观察所述洗涤后的支架-细胞复合体系时，使所述支架-细胞复合体系悬浮在无血清的DMEM培养基中。本专利技术实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本专利技术实施例提供的检测亲水支架上细胞培养状态的方法，利用吖啶橙染色液特异性结合DNA时可发出绿色荧光，特异性结合RNA时可发出橙色荧光，可对亲水支架上细胞培养状态进行细胞无损地、实时以及动态地检测。由于吖啶橙染色液与不含有DNA和RNA的亲水支架无法进行特异性结合，且本专利技术提供的方法通过磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤，可除去物理性吸附在亲水支架上的吖啶橙染色液，从而利用激光扫描共聚焦显微镜，并在绿色荧光通道和橙色荧光通道下对支架-细胞复合体系进行观察时，只能观察到亲水支架上细胞的分布与生长状态，从而使检测结果更加准确可靠。可见，本专利技术实施例提供的方法能够清晰、准确地检测亲水支架上细胞的分布情况及生长状态，且操作简便，便于规模化推广应用。【附图说明】为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1-1是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架在特定层面上的激光扫描共聚焦显微镜扫描图像；图1-2是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA在特定层面上的激光扫描共聚焦显微镜扫描图像；图1-3是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的RNA在特定层面上的激光扫描共聚焦显微镜扫描图像；图1-4是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系在特定层面上的激光扫描共聚焦显微镜扫描图像；图2-1是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的复合图像的二维平面图；图2-2是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的复合图像的二维平面图；图2-3是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的RNA各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的复合图像的二维平面图；图2-4是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的复合图像的二维平面图；图3-1是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的三维图像；图3-2是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的DNA各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的三维图像；图3-3是本专利技术实施例1提供的，SD大鼠骨髓间充质干细胞的RNA各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的三维图像；图3-4是本专利技术实施例1提供的，魔芋葡甘聚糖微球支架-SD大鼠骨髓间充质干细胞复合体系各个断层扫描图像按顺序复合叠加后，所得到的三维图像。【具体实施方式】为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。本专利技术实施例提供了，包括以下步骤:步骤101、将待检测细胞接种到亲水支架上进行培养，至待检测细胞在亲水支架上的生长融合率为90 % -95 %时，获得支架-细胞复合体系。步骤102、采用吖啶橙染色液对支架-细胞复合体系进行荧光染色，并采用磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤。步骤103、将洗涤后的支架-细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观察，从而检测得到亲水支架上细胞的培养状态。本专利技术实施例提供的检测亲水支架上细胞培养状态的方法，利用吖啶橙染色液特异性结合DNA时可发出绿色荧光，特异性结合RNA时可发出橙色荧光，可对亲水支架上细胞培养状态进行细胞无损地、实时以及动态地检测。由于吖啶橙染色液与不含有DNA和RNA的亲水支架无法进行特异性结合，且本专利技术提供的方法通过磷酸缓冲盐溶液对染色后的支架-细胞复合体系进行洗涤，可除去物理性吸附在亲水支架上的吖啶橙染色液，从而利用激光扫描共聚焦显微镜，并在绿色荧光通道和橙色荧光通道下对支架-细胞复合体系进行观察时，只能观察到亲水支架上细胞的分布与生长状态，从而使检测结果更加准确可靠。可见，本专利技术实施例提供的方法能够清晰、准确地检测亲水支架上细胞的分布情况及生长状态，且操作简便，便于规模本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测亲水支架上细胞培养状态的方法，包括：步骤a、将待检测细胞接种到亲水支架上进行培养，至所述待检测细胞在所述亲水支架上的生长融合率为90％‑95％时，获得支架‑细胞复合体系；步骤b、采用吖啶橙染色液对所述支架‑细胞复合体系进行荧光染色，并采用磷酸缓冲盐溶液对染色后的所述支架‑细胞复合体系进行洗涤；步骤c、将洗涤后的所述支架‑细胞复合体系置于激光扫描共聚焦显微镜下，并利用绿色荧光通道和橙色荧光通道进行观察，从而检测得到所述亲水支架上细胞的培养状态。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：敖英芳，孟庆阳，黄洪杰，皮彦斌，袁兰，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，
类型：发明
国别省市：北京;11