本发明专利技术公开了盐酸苄丝肼促进了逆胆固醇转运途径(RCT)过程从而起到防治动脉粥样硬化的作用。本发明专利技术通过建立泡沫巨噬细胞及动脉粥样硬化条件下的肝细胞模型研究了盐酸苄丝肼的对逆胆固醇转运(RCT)过程中两个至关重要的限速受体(ATP结合盒转运体A1，清道夫受体B1)表达的影响，尤其对肝脏SRB1具有极显著促进作用，进而促进了逆胆固醇转运(RCT)最后一步，于动脉粥样硬化疾病的防治作用具有极其重要的意义，此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，主要涉及盐酸苄丝肼对逆胆固醇转运途径(RCT)两个重要限速受体表达的影响，从而促进逆胆固醇转运途径(RCT)起到逆转动脉粥样硬化的作用。
技术介绍
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)已经成为人类死亡的重要原因，其中普遍认为高密度脂蛋白(HDL)具有抑制动脉粥样硬化的作用，其主要通过其介导的逆胆固醇转运途径(RCT)来实现。逆胆固醇转运途径(RCT)，主要通过由多种途径促进巨噬细胞的胆固醇外流，并促进ApoA-1和HDL脂化，随后成熟的HDL被转运至肝脏进行排泄分泌进而阻碍动脉粥样硬化。其中ATP结合盒转运体Al (ABCAl)是主要负责巨噬泡沫细胞内胆固醇流出并形成HDL的途径，但其他较低效率的外流途径如被动流出也参与其中。ABCAl促进胆固醇和磷脂的单向流出成游离脂质或缺脂载脂蛋白，同时ABCAl也涉及在ApoA-1的脂化形成初期高密度脂蛋白(HDL)。ABCAl与细胞胆固醇外流至HDL联系密切，其表达降低或突变将降低血浆HDL，胆固醇，胆固醇酯在细胞积聚从而导致高密度脂蛋白缺乏症，同时在小鼠巨噬细胞超表达ABCAl发现主动脉动脉粥样硬化斑块发展被显著抑制。胆固醇外流成为游离胆固醇后再进行酯化，转运最后成熟的HDL主要被肝脏SRBl摄取HDL中的胆固醇。大量数据表明SRBl是HDL代谢的一个具有决定性的调控因子，发现在SRBl基因敲除小鼠中SR-BI介导的肝脏摄取高密度脂蛋白胆固醇的摄取几乎完全被阻塞，同时多篇文献报道肝脏SRBl的表达对动脉粥样硬化的抑制作用极有可能因为其作为逆胆固醇转运最后一步的调控因子能够潜在提高胆固醇流入肝脏。有实验表明，在小鼠肝脏所表达的SRBl显示了对调节RCT的重要的作用，肝脏SRBl的超表达可促进RCT的过程进而降低了动脉粥样硬化，显著的促进了肝脏摄取HDL胆固醇同时降低了血浆HDL胆固醇水平。盐酸苄丝肼为白色或类白色结晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其性质极不稳定，对溶剂PH、光线、温度及湿度的变化极为敏感。盐酸苄丝肼作为肼衍生物是一种氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)抑制剂，它可在动脉，心脏脂肪组织及血液循环等中代谢苄胺从而可抑制SSAO活性。SSAO可将内源性胺及外源性物质转换成更多的有毒代谢物，其参与发展内皮损伤、动脉斑块形成等，与糖尿病、动脉粥样硬化等心血管类疾病形成高度相关。
技术实现思路
本专利技术采用不同浓度的盐酸苄丝肼作用于泡沫巨噬细胞及肝细胞模型，结果发现随着盐酸苄丝肼浓度变化，逆胆固醇转运途径(RCT)两个关键限速受体ABCAl，SRBl表达均表现出浓度依赖性，尤其肝脏SRBl受体在盐酸苄丝肼浓度为10 \ 10 8、10 9M时，表达量与模型组具有极显著性差异，从而促进了逆胆固醇转运途径(RCT)最后一步。下面是药理学部分试验及结果:一、建立实验细胞模型取生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的对数生长期人单核细胞THPl以I X 106细胞/孔的密度均匀接种于6孔培养板，经100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后细胞贴壁并长出伪足即成功分化为人巨噬细胞，将细胞分别加入不同浓度oxLDL(0，25，50，100 μ g/ml)作用24h后进行油红O染色及cell-based ELISA检测。取生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的对数生长期正常肝细胞L02以I X 106细胞/孔的密度均匀接种于6孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分别加入不同浓度 oxLDL (0，25，50，100 μ g/ml)作用 24h 后进行 cell-based ELISA 检测。二、给药后巨噬细胞ABCAl进行cell-based ELISA检测取生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的对数生长期人单核细胞THPl以I X 15细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板，经100ng/ml佛波酯(PMA)刺激72h后细胞贴壁并长出伪足即成功分化为人巨噬细胞，将细胞分为空白组、模型组、药物组。除空白组外，其余组用100 μ g/ml浓度oxldl刺激作用24h后成为泡沫巨噬细胞，药物组分别加入不同浓度盐酸苄丝肼(10 6、10 1、10 8、10 9、10 10、10 11UO 12、10 13M)各100 μ 1，置于培养箱中培养。孵育24h后，弃培养液，洗涤干燥后进行cell-based ELISA检测。三、给药后肝细胞SRBl进行cell-based ELISA检测取生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液的对数生长期正常肝细胞L02以I X 15细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24h细胞贴壁后，将细胞分为空白组、模型组、药物组。除空白组外，其余组用100 μ g/ml浓度oxldl刺激作用24h后即成功建立动脉粥样硬化肝细胞模型，药物组分别加入不同浓度盐酸苄丝肼(10 6、10 7UO 8UO 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)各100 μ I，置于培养箱中培养。孵育24h后，弃培养液，洗涤干燥后进行 cell-based ELISA 检测。【附图说明】图1是THPI细胞空白组油红O染色图。图2是THPl细胞加25 μ g/ml的oxLDL作用组油红O染色图。图3是THPl细胞加50 μ g/ml的oxLDL作用组油红O染色图。图4是THPl细胞加100 μ g/ml的oxLDL作用组油红O染色图。图 5 是 THPl 细胞分别加 0、25、50、100yg/ml 的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA结果。图6是11)2细胞分别加0、25、50、10(^8/1111的 oxLDL 作用的 cell-based ELISA结果。图7是THPl细胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同浓度盐酸苄丝肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 结果。图8是L02细胞在100 μ g/ml的oxLDL作用造模后加不同浓度盐酸苄丝肼(10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 n、10 12、10 13M)的 cell-based ELISA 结果。【具体实施方式】I)油红O染色细胞经PBS洗涤一4%多聚甲醛固定10?20min_ — PBS洗涤一油红O染色15min —水洗脱色一显微镜观察2) cell-based ELISA 检测细胞孵育24h后，弃培养液，洗涤干燥后4%多聚甲醛固定细胞20-30min，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，0.6% H202/PBS/Triton χ-100 孵育 20_30min 阻断内源性过氧化物酶，PBS/Triton X-100 漂洗 5minX 3 次，10% BSA 于 37°C封闭 lh40min, 50ul5% BSA稀释SRBl —抗4°C孵育过夜，PBS/Triton X-100漂洗5minX 3次，50ul5% BSA稀释辣根过氧化物酶标记二抗于37°C孵育lh，PBS/Triton X-100漂洗5minX3次，PBS漂洗5m本文档来自技高网...
【技术保护点】
盐酸苄丝肼用于促进逆胆固醇转运途径的药物用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何书英，方婷欢，余新超，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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