肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，属于转基因领域，涉及斑马鱼。采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因的启动区序列；利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒；通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。选用一种新的荧光蛋白基因mCherry，应用了Tol2转座子体系来构建在肌细胞中特异表达的mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因领域，涉及斑马鱼，尤其是涉及肌细胞特异表达mCherry荧光 蛋白斑马鱼家系构建方法。
技术介绍
斑马鱼具有易于养殖、体外受精、胚胎透明、生活史短等优点，是研究脊椎动物早 期发育的模型动物。在基础科学研究中，利用转基因技术，让荧光蛋白特异地表达在组织器 官中，已成为一种重要的研究手段。伴随着基础研究的扩展，一些体表呈现绚丽色彩的转基 因斑马鱼家系极具观赏效果。早在2003年，美国政府就批准了一部分转基因斑马鱼可作为 观赏鱼上市销售，使得转基因斑马鱼进入大众视野，带来了显著的市场效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供肌细胞特异表达mCherry焚光蛋白斑马鱼家系构建方法。 本专利技术包括以下步骤： 1)采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因（Myosinlight chain2，Mlc2f)的启动区序列； 2)利用pCS2-mCherry质粒和pminiTol2 空载体，构建pminiTol2-Mlc2f-mCherry 质粒； 3)通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry焚光蛋 白斑马鱼家系。 在步骤1)中，所述采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因 (Myosin light chain 2, Mlc2f)的启动区序列的具体方法可为： 取斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因组DNA;根 据斑马鱼Mlc2f启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特异引物：Mlc2f-fw:5'-AGCM GCTTAGCCGACAGACTCACAGGATA-3' (下划线部分为Hindlll酶切位点），Mlc2f_rv: 5'_ATGGGA TCCAAGTCTGAAGCCGCGTAGTG-3' (下划线部分为BamHI酶切位点）；以斑马鱼基因组DNA为模 板，进行PCR扩增，反应条件如下：94°C预变性3min，每个循环包括94°C变性30s，57°C复性 30s，72°C延伸lmin，共34个循环，最后1个循环结束后再72°C延伸lOmin;扩增片段经切 胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄青霉素筛选，得到pMD19T-Mlc2f单 克隆，摇菌，提取质粒，测序鉴定。 在步骤2)中，所述利用pCS2_mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建 pminiTol2_Mlc2f-mCherry质粒的具体方法可为： 用限制性内切酶Hindlll/BamHI双酶切pMD19T-Mlc2f和pCS2-mCherry质 粒，切胶回收带有酶切位点的Mlc2f片段以及pCS2-mCherry骨架，连接、测序鉴定得 到pCS2_Mlc2f-mCherry质粒；然后用Hindlll/Notl双酶切pCS2_Mlc2f-mCherry和 pminiTol2质粒，切胶回收Mlc2f-mCherry片段以及pminiTol2骨架，连接、测序鉴定得到 pminiTol2_Mlc2f-mCherry质粒。 在步骤3)中，所述通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达 mCherry焚光蛋白斑马鱼家系的具体方法可为： (1)体外合成Tol2转座酶加帽mRNA: 用限制性内切酶BamHI酶切pT3TS-T〇12质粒，切胶回收得到线性片段，然后使 用mMESSAGEniMACHINE'KT3试剂盒进行体外转录得到Tol2转座酶加帽mRNA，Nanodrop 2000测定浓度； (2)mCherry转基因斑马鱼家系的建立： 产卵前一天将雌雄鱼以1 : (1~2)比例配对，放在同一繁殖缸中并用隔板隔 开，第二天早上拿掉隔板进行配对产卵；收集发育到1~2细胞期的胚胎后，将含有质粒 pminiTol2_Mlc2f-mCherry(50ng/yL)和Tol2 转座酶加帽mRNA(50ng/yL)的液体（总 体积为2nL)注射到受精卵中；注射后的受精卵放在E3培养液（5mmol/LNaCl，0. 17mmol/ LKC1，0. 33mmol/LCaCl2,0. 33mmol/LMgS04)，置于 28°C恒温培养箱中培养，并在注射后 72h 于荧光显微镜下观察筛选具有荧光信号的胚胎个体，作为Mlc2f-mCherry转基因鱼F0代进 行孵化培养；代鱼性成熟后与野生型斑马鱼配对，从而筛选出可传代F1代杂合个体，并 将其培养至性成熟后再进行同质配对，最终获得肌细胞稳定表达mCherry荧光蛋白的斑马 鱼纯合转基因家系。 本专利技术选用一种新的荧光蛋白基因mCherry，应用了T〇12转座子体系来构建在肌 细胞中特异表达的mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。【附图说明】 图 1 为pminiTol2-Mlc2f-mCherry质粒结构不意图。 图2为各个时期的转基因斑马鱼。在图2中，图A、B为受精26h后胚胎；C为初孵 仔鱼；D为成鱼。在图A中，标尺为2mm，在图B中，标尺为500μm。【具体实施方式】 1. 1 材料 1. 1. 1菌种与载体 pCS2_mCherry质粒来自本申请人实验室，Escherichia,coliDH5α菌株来自 TaKaRa公司，pMD19T(Simple)质粒购自TaKaRa公司，Το12转座子体系质粒pminiTol2、 pT3TS-Tol2 购自Addgene公司。 1. 1. 2酶与化学试剂 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，限制性内切酶、T4连接 酶购自NEB公司，mMESSAGEmVIACH丨NFJT3(AM1348)试剂盒购自Ambion公司； 1. 1. 3实验动物 试验用斑马鱼属于Tuebingen家系，在本实验长年繁育。 1. 1. 4主要仪器设备 PCR仪（Mastercyclernexus，eppendorf公司），离心机（Centrifuge54：24， eppendorf公司），焚光体式显微镜（M165FC，Leica公司），气动皮升栗（PV830,WPI公 司），显微注射仪（M_152，Narishige公司），立体解剖显微镜（S6D，Leica公司），Nanodrop 2000 (Thermo scientific公司）。 1. 2 方法 1. 2. 1 Mlc2f启动子的克隆 取20mg新鲜斑马鱼肌肉，按海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取基因 组DNA ;根据NCBI上已报道的斑马鱼Mlc2f启动子基因序列，设计一对引入酶切位点的特 异引物：Mlc2f-fw:5' -AGCAAGCTTAGCCGACAGACTCACAGGATA-3'(下划线部分为Hindlll酶 切位点），Mlc2f-rv:5' -ATGGGATCCAAGTCTGAAGCCGCGTAGTG-3?(下划线部分为BamHI酶切 位点）。以斑马鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，反应条件如下：94°C预变性3min，每个 循环包括94°C变性30s，57°C复性30s，72°C延伸lmin，共34个循环，最后1个循环结束后 再72°C延伸lOmin。扩增片段经切胶回收后进行TA克隆连入pMD19T(Simple)质粒，氨苄 青霉素筛选，得到pMD本文档来自技高网...
【技术保护点】
肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用PCR方法，从斑马鱼基因组中得到肌球蛋白轻链2基因的启动区序列；2)利用pCS2‑mCherry质粒和pminiTol2空载体，构建pminiTol2‑Mlc2f‑mCherry质粒；3)通过对斑马鱼胚胎进行显微注射的方法，构建肌细胞特异表达mCherry荧光蛋白斑马鱼家系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈仕玺，黄晶，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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