本发明专利技术公开了一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，该细胞株的命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015174。本发明专利技术同时提供了该细胞株的制备方法及其在制备移植性肝癌模型中的应用。本发明专利技术为了获得转移率较高的细胞，采用了改良的大鼠肝癌诱导方法，然后取生长良好的肿瘤组织采用直接细胞单层培养法进行原代培养，以获得大鼠肝癌细胞，然后利用Transwell小室筛选出高转移潜能的细胞，并用以制备移植性大鼠肝癌模型，将十分有利于分析肝脏肿瘤转移机理。另外，我们采用克隆化培养纯化细胞，选取生长良好的高转移潜能细胞进行了保藏，并通过一系列实验证明所筛选的Wrh-f2细胞株为肝癌细胞株，其具有良好的成瘤特性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物癌细胞株及其制备技术，具体的说是一种。
技术介绍
随着肝癌相关研究的不断发展，作为临床前体内研究的基础，肝癌动物模型的建立也在不断进步。诱发性肝癌模型因能较好地模仿人肝癌过程仍是现在肝癌研究中应用的最为广泛的动物模型。然而，诱发性肝癌动物模型具有周期长(2~5个月)、成本高、成功率低、不易同时得到病程和肿块大小相对均一的模型等缺点，其应用过程中收到一定限制。而以移植的方法制作肝癌模型具有动物饲养简单、移植方法简便、移植成功率高、肿瘤生长快、患鼠生存期短、肿瘤生物学特性稳定而均一等优点。另一方面，在肝癌的治疗方面，长期以来手术切除仍被公认为肝癌根治的最好手段。但肝癌的术后复发和转移又直接影响了手术疗效，肝癌的转移复发已成为进一步延长肝癌病人生存、改善预后的主要障碍。因此，如果能建立一种具有高转移率的肝癌移植模型，就能对肝癌的转移复发机理进行更深层次的探究。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，该细胞株可用于制备具有高转移率的移植性大鼠肝癌模型，为肝癌细胞转移机理的研究提供了更为优质的模型来源。另外，本专利技术还提供了该细胞株的制备方法及其在制备大鼠肝癌模型中的应用。本专利技术所提供的一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，其命名为大鼠肝癌细胞Wrh-f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C2015174，保藏地址:中国湖北省武汉市武汉大学。本专利技术所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株的制备方法，其包括以下步骤: (1)、取雄性Wistar大鼠，第1天按100mg/kg腹腔注射一次DEN;从第2天起，以每7天为一个循环单位，先连续五天给予含lOOppm的NM0R饮水，任其自由饮用，然后连续两天给予无菌水，任其自由饮用； (2)、第20周末，无菌条件下取肝脏肿瘤组织，切成0.5-1.0_3大小的组织块，采用单层细胞培养法将组织块加入24孔板中进行培养，48h后半数换液，此后每3d换一次液；本步骤中所用培养基为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基； 培养的第5d，肝癌细胞从组织块中爬出，培养的第14d行第1次传代，培养的第24d行第2次传代； (3)、将培养24d的肝癌细胞所用培养基更换为无血清培养基并继续培养24h，然后使用胰酶进行消化，按1 X 105个细胞/小室接种到成胶Transwell小室内，然后将小室放入24孔板，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37°C、5%C02条件下培养24h后，取出小室，可见24孔板底有肝癌细胞生长； 所述成胶Transwell小室是将Matrigel和DMEM以体积比1: 4混合后加至Transwell小室内制成人工基质膜而得； (4)、将步骤(3)中24孔板的板底肝癌细胞收集后，加含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养，待肝癌细胞长满，扩大培养至50mL培养瓶中； (5)、取扩大培养的肝癌细胞，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释至1个细胞/200 μ L，然后按200 μ L/孔加入96孔板进行克隆化培养，7d后取生长良好的单克隆细胞株，即为高转移潜能的大鼠肝癌细胞株。另外，本专利技术还提供了所述具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株在制备移植性肝癌模型中的应用。该应用的实现方案是:选择体重为120_130g的雄性Wistar大鼠，将Wrh_f2细胞株做成细胞泥，每只大鼠肝包膜下接种0.04ml，然后饲养2周，得移植性大鼠肝癌模型。本专利技术为了获得转移率较高的细胞，采用了改良的大鼠肝癌诱导方法，然后取生长良好的肿瘤组织采用直接细胞单层培养法进行原代培养，以获得大鼠肝癌细胞，然后利用Transwell小室筛选出高转移潜能的细胞，并用以制备移植性大鼠肝癌模型，将有十分利于分析肝脏肿瘤转移机理。另外，我们采用克隆化培养纯化细胞，选取生长良好的高转移潜能细胞进行了保藏，并通过一系列实验证明所筛选的Wrh-f2细胞株为肝癌细胞株，其具有良好的成瘤特性。【附图说明】图1是采用单层细胞培养法所培养的肝癌细胞第14d时生长状况。图2是采用Transwell小室筛选方法筛选得到的高转移潜能肝癌细胞。图3是培养得到的高转移潜能单克隆肝癌细胞株。图4是倒置相差显微镜观察高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞形态。图4 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图5是透射电镜观察高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞形态。图5 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图6是高、低转移潜能肝癌细胞株染色体形态分析染色结果。图6 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图7是流式细胞仪检测高、低转移潜能肝癌细胞株细胞周期结果。图7 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图8是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片HE染色结果。图8 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图9是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片AFP蛋白免疫组化染色结果。图9 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图10是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片CK7蛋白免疫组化染色结果。图10 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh_s2。图11是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞爬片CK8蛋白免疫组化染色结果。图11 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图12是高、低转移潜能肝癌细胞株的迀移实验结果。图12 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图13是高、低转移潜能肝癌细胞株的细胞克隆形成率实验结果。图13 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图14是高、低转移潜能肝癌细胞株分别裸鼠腋下接种1周后肿瘤生长状况。图14中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh_s2。图15是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠腋下接种1周后肿瘤HE染色结果。图15 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh_s2。图16是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肿瘤生长及转移状况。图16中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh_s2。图17是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肝脏肿瘤HE染色结果。图17 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图18是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于裸鼠肝包膜下接种细胞2周后肺脏肿瘤HE染色结果。图18 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图19是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠腋下接种2周后肿瘤生长状况。图19中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh_s2。图20是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠腋下接种2周后肿瘤HE染色结果。图20 中:1 为 Wrh-f2，2 为 Wrh-s2。图21是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠肝包膜下接种细胞2周后肿瘤生长及转移状况。图21中箭头所指为肿瘤生长的位置，1为Wrh-f2，2为Wrh_s2。图22是高、低转移潜能肝癌细胞株分别于大鼠肝包膜下接种细胞2周后肝脏肿瘤HE染色结果。图22 中:1 为 Wrh当前第1页1 2 3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有高转移潜能的大鼠肝癌细胞株，其特征是，该细胞株的命名为大鼠肝癌细胞Wrh‑f2，于2015年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2015174。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张焕铃，刘树锋，宋蕾，王昭，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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