本发明专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。本发明专利技术从茶(Camellia sinensis)叶中筛选得到了能高效催化形成GABA的谷氨酸脱羧酶CsGAD，通过利用序列敲除方法获得切除了谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端31个氨基酸的序列即谷氨酸脱羧酶CsGADm，其具有更高的催化形成GABA的活性；谷氨酸脱羧酶CsGAD和谷氨酸脱羧酶CsGADm的催化活性分别达0.99±0.09、1.67±0.34mg GABA/mg protein/min。本发明专利技术利用植物来源的谷氨酸脱羧酶生物合成生产γ-氨基丁酸，具有来源安全、工艺简单、转化时间快、转化率高等优点，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体来说涉及一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和 应用。
技术介绍
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricEtcidy-ciminobutcinoic￡icid，间矛尔GABA) 一种功能性氨基酸，广泛分布于动植物及微生物中的一种非蛋白氨基酸，是存在于哺乳动 物脑、脊髓中的抑制性神经传递物质，对生物体生命活动起着不可替代的作用。GABA具有延 缓衰老、降血压、调节激素分泌、治疗癫痫、治疗帕金森病的功能。此外GABA作为中枢神经 系统中的一种重要的抑制性神经递质，还可以镇痛、保肝、活肾、解酒毒、抗脑缺血、抗焦虑、 抗心律失调、治疗哮喘、调节胃酸分泌等功能。2009年9月27日，卫生部批准GABA为新资 源食品，作为新资源食品的GABA，由于化学合成GABA存在较大的安全性问题，不适合应用 于食品的开发。因此，利用生物合成法生产GABA是一条相对安全与有效的途径。 目前生物合成法生产GABA均采用微生物技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发 酵生产GABA，主要利用的是微生物中自身所含有GABA合成基因。然而利用植物来源的GABA 合成基因生物合成GABA相对很少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中植物来源的GABA合成基因种类少、合成GABA效 率低的不足，提供一种植物来源的、能高效催化合成GABA的谷氨酸脱羧酶及其编码基因和 应用。 申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶（Camelliasinensis)叶具 有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶 基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其 生物合成形成GABA的转化率，并最终获得基于植物源基因生物合成形成的GABA。 本专利技术的第一个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGAD，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示，其含有493个氨基酸残基。 本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD的谷氨酸脱羧 酶基因CsGAD。 优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其含有 1482bp的碱基。 本专利技术的第三个目的是提供一种谷氨酸脱羧酶CsGADm，其氨基酸序列如SEQID NO. 4所示，其含有462个氨基酸残基。 本专利技术的第四个目的是提供一种编码所述的谷氨酸脱羧酶CsGADm的谷氨酸脱羧 酶基因CsGADm。 优选，所述的谷氨酸脱羧酶基因CsGADm的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，其含 有1389bp的碱基。 本专利技术的第五个目的是提供所述的谷氨酸脱羧酶CsGAD和/或谷氨酸脱羧酶 CsGADm在催化生成γ-氨基丁酸（GABA)中的应用。 本专利技术利用序列敲除方法，改造了谷氨酸脱羧酶CsGAD。对谷氨酸脱羧酶CsGAD 的修饰是通过切除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端的31个氨基酸序列而得到谷氨酸脱羧酶 CsGADm，谷氨酸脱羧酶CsGADm的编码基因即谷氨酸脱羧酶基因CsGADm对应为切除了谷氨 酸脱羧酶基因CsGAD的3'端的93bp核苷酸后得到的序列。本专利技术的谷氨酸脱羧酶CsGAD 具有较高的催化活性，达〇. 99±0. 09mgGABA/mgprotein/min，谷氨酸脱羧酶CsGADm的催 化活性更是大大提高，达1. 67±0. 34mgGABA/mgprotein/min。每50ml经异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷诱导培养的含有重组质粒pET-32a_CsGADm的EscherichiacoliRosetta重组 菌菌液可产生24. 2mg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白，lmg重组谷氨酸脱羧酶CsGADm蛋白 151^11可完成转化35.2811^1^-谷氨酸全部生成6484，转化率达100%。本专利技术利用植物来 源的谷氨酸脱羧酶生物合成生产γ-氨基丁酸，具有来源安全、工艺简单、转化时间快、转 化率高等优点，具有良好的应用前景。【附图说明】 图1是重组谷氨酸脱羧酶CsGADm纯化蛋白的SDS-page结果，Marker的单位为 KDa〇【具体实施方式】 以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。 实施例1: 申请人研究发现与其他植物相比，厌氧胁迫处理的茶（Camelliasinensis)叶具 有产生高含量GABA的能力，并从茶叶中筛选出了具有高效转化形成GABA的谷氨酸脱羧酶 基因CsGAD，此外还发现谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列会抑制其转化形成GABA的活性，切 除谷氨酸脱羧酶CsGAD的C端序列后得到的蛋白（谷氨酸脱羧酶CsGADm)能进一步提高其 生物合成形成GABA的转化率。 以下对实施的具体步骤进行说明：a)茶叶RNA的提取及cDNA的获得： RNA提取用华越洋的超快型植物RNA提取试剂盒GK系列。具体步骤为：取0. 05g用 液氮磨碎的茶（Camelliasinensis)叶加入0. 5ml裂解液，混勾，加入150μ1去蛋白液（取 下层），加入100μ1氯仿，混勾30s，离心（12000Xg)5min，取上清350μ1，加入等体积漂洗 液，颠倒混匀，分两次上柱，离心（12000Xg) 30s，加入500μ1洗柱液，离心（12000Xg) 30s， 重复洗柱步骤，再次离心（12000Xg)lmin，将柱移至新离心管中，加50μ1水，室温静置 3min，离心（12000Xg)lmin，提取得到茶叶RNA，保存于_80°C。 将茶叶RNA逆转录成cDNA用TAKARA公司的PrimeScript?RTreagentKitwith gDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒。取出-80°C冻存的茶叶RNA，待融化后，根据说 明书加入DNA酶后，42°C2min消化DNA，再加入反转录试剂，37°C15min，85°C5sec;得到逆 转录的cDNA。 b)谷氨酸脱羧酶基因CsGAD和修饰后的谷氨酸脱羧酶基因CsGAD(谷氨酸脱羧酶 基因 CsGADm)的克隆： 利用生物信息学分析方法，根据已知的谷氨酸脱羧酶基因序列，设计用于扩增谷 氨酸脱羧酶基因CsGAD的引物序列为：F: 5' -GCGGCCGCATGGTTCTGTCAAAGACAACATCG-3' ； R:5' -GTCGACTTAGCAAACACCATTAGTCTTCTT-3'。反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara 的PrimeSTARMaxPremix(2X)10yl，F和R引物各ΙΟμΜ，逆转录的cDNA模板(λΙμL， 加双蒸水补足20μ1。PCR扩增程序为98°C30sec，l个循环；98°C15sec，55°C15sec， 72°C30sec，33个循环；72°ClOsec，1个循环。由此扩增得到谷氨酸脱羧酶基因CsGAD全长 序列，把全长序列克隆连接到表达载体pET-32a(含有His标签，Novage当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种谷氨酸脱羧酶CsGAD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨子银，梅鑫，傅秀敏，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东;44
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