本发明专利技术提供一种人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物以及试剂盒，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针。本发明专利技术能够用于膀胱癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价等方面，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及人TWISTI/Vimentin基因甲基化检测标志物 及试剂盒
技术介绍
膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全 身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于 前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6. 61/10万，列恶性肿 瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加， 高发年龄50~70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3~4倍。临床上膀胱癌具有恶性程度 高、术后复发率高等特点，因此早期诊断对治疗和预防复发有着非常重要的意义，可以增加 保留膀脫的机会并提尚患者总体生存率。 众所周知，恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程。大量研究表明， 有一套特定基因的改变导致并推动了癌症的发生发展：染色体不稳定性、微卫星不稳定性、 表观遗传学改变等。表观遗传是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以 遗传给子代细胞的基因组修饰作用，目前最为人们所知的表观遗传学主要方式是DNA甲基 化。由于DNA甲基化往往发生在膀胱癌发生过程中的早期，很容易在患者的尿液中检测到。 因此，检测尿液中DNA甲基化状态有望成为膀胱癌早期无创诊断的一条新途径。 膀胱癌DNA分子甲基化检测组合物一直以来都没有其特有的基因，多数研究是联 合几个基因同时检测尿液中基因甲基化水平，以此来提高灵敏度与特异性。根据最新的文 献报道，研究人员已经通过大规模的基因筛选和样本测序，发现在膀胱癌发生早期尿液脱 落细胞中1-2个基因的甲基化概率明显增加，这为膀胱癌早期辅助诊断提供了可靠的检测 标志物。 TWIST1是碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子，其mRNA在胎盘 组织表达量最高，在胚胎发生、发展中发挥重要作用。它参与上皮间质转化过程的调控，进 而影响肿瘤的侵袭与转移。转移性肿瘤中常见TWIST1过表达或启动子的甲基化。目前国 内外涉及膀胱肿瘤与TWIST1基因的相关性研究包括，TWIST1蛋白表达与肿瘤的相关性分 析，以及尿液标本甲基化水平检测。IsabelleRenard等人研究发现，在膀胱癌尿液样本中 TWIST1甲基化的检出率达到88%，特异性达到94%。 Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复杂的基因表达模 式，主要表达于胚胎组织和来源于间叶组织的成体细胞。越来越多的研究表明，Vimentin 的表达不再是间充质起源细胞、向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志，它也在乳腺癌、 膀胱癌、子宫内膜癌等上皮源性恶性肿瘤中共同表达，而且与癌细胞的侵袭性强和易转移 密切相关。另有研究证实，与肿瘤癌前病变（如腺瘤）产生相关的Vimentin的表达下调可 能与其启动子的甲基化密切相关，这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin表 达，其对于肿瘤细胞迀移具有促进作用。目前，膀胱镜检查、对可疑病变组织进行活检以及对尿液进行细胞学检查仍然是 膀胱肿瘤临床最常用的诊断和随访方法。然而，膀胱镜检查是一种侵入性且昂贵的检查方 法，给患者带来痛苦及经济负担；尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，给临床应用 带来不便。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的膀胱癌检测标志物以及试剂 盒，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案是：人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测标 志物，所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWISTl、Vimentin和ACTB三种 基因的甲基化引物和探针； 所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是： 〇 本专利技术还提供一种人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所 述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒包括： 提取试剂：尿液保存液、尿液漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗脱液； 硫化纯化试剂：硫化试剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液1、纯化漂洗液2、 纯化漂洗液3、洗脱液；PCR检测试剂：TWIST1PCRMix、VimentinPCRMix、ACTBPCRMix、阴性质控品、阳 性质控品、聚合酶。 所述人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首 先95 °C变性5分钟，然后95 °C变性20秒、62 °C退火40秒，并进行45次循环，PCR循环过程 中，仪器升降温速度设定为1. 3°C/S，最后40°C维持30秒。所述PCR结果在LighiCycier?.480II上进行TWISTl/Vimentin/ACTB的Cp值分 析，根据空白对照组、阴性质控品、阳性质控品、待测样品的扩增情况，确定试验结果的有效 性并对样本结果进行判读。 所述PCR结果的分析具体如下： 1)在LjghtCycIcrQD48〇基本软件模块栏中选择"Analysis Overview"； 2)选择"AbsQuant/2ndDerivativeMax" 分析模式； 3)选择"FilterComb465-510" ； 4)点击"Calculate"，软件自动给出目的基因TWISTl/Vimentin的Cp值； 5)选择"FilterComb533-580" ； 6)点击"Calculate"，软件自动给出内参基因ACTB的Cp值。 所述PCR结果的具体判读如下表： 若判读结果为阴性，患膀胱癌风险性较低；若判读结果为阳性，患膀胱癌风险较 高，建议镜检确认。 本试剂盒采用荧光PCR法检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化指标。将待测DNA 样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照进行PCR扩增反应，对检测基因和内参基因进 行双重PCR扩增反应。通过对所述待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照的 参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的检测基因的甲基化情况。 本专利技术选择TWIST1和Vimentin两个基因中的标志片段进行膀胱癌检测，未见于 任何报道，将其作为检测标志物，灵敏度高、特异性强。本专利技术组合物首次建立TWIST1和 Vimentin双基因联合检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化体系，不仅可以用于膀胱癌早期 诊断，还可以预测术后复发。 本专利技术在较少样本体积（5mL)下进行，依然可得到相同水平的灵敏度和特异性， 可适用于小体积样本的检测。 采用本专利技术检测膀胱癌尿液中TWIST1与Vimentin甲基化情况，具有操作简单、快 速、灵敏度高，特异性好，无创伤等优点，适合于复发率很高的膀胱癌的早期诊断与随访，使 需定期进行膀胱镜检查的患者数量明显减少，具有很高的临床应用价值。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细的说明。 实施例 1、人TWISTl/Vimentin基因甲基化检测体系 样本：人尿液样本、阳性质控品、阴性质控品以及空白对照样本； 仪器：Lightcycler480、高速离心机、金属浴、PCR仪、漩涡震荡仪等；TWIST1、Vimentin和ACTB三个基因的甲基化引物和探针如下所示： 2、人TWIS本文档来自技高网...
【技术保护点】
人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物，其特征在于，所述人TWIST1/Vimentin基因甲基化检测标志物包括TWIST1、Vimentin和ACTB三种基因的甲基化引物和探针；所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：引物、探针序列(5‘‑3’)TWIST1‑FCGGTAAGAAGTTTGCGGGTTGTWIST1‑RAAATACGCTAACGCTCCCTWIST1‑PFAM‑AGCGGCGGCGGGAGTT‑MGBVimentin‑FTAATCGGCGGGATAGTAGGGVimentin‑RGCGCCTCTATCCATCGACTTVimentin‑PFAM‑CGTCGTTTCGTAATTTTCG‑MGBACTB‑FGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTTACTB‑RCCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAAACTB‑PVIC‑ACCACCACCCAACACACAA‑MGB。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，吉学桥，张田田，
申请(专利权)人：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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