本发明专利技术公开了一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途。将本发明专利技术提供的载体pTol2(UAS:Cas9)导入单细胞期斑马鱼胚胎，获得的Tg(UAS:Cas9)品系与Tg(kop:KalTA4品系)雌鱼杂交后，获得的杂交胚胎能够在斑马鱼原始生殖细胞中高效、特异、持续表达Cas9基因。在制备突变品系时，以Tg(UAS:Cas9)雄鱼与Tg(kop:KalTA4)雌鱼杂交胚胎作为受体胚胎，直接注射靶向基因的gRNA后，能够有效减少体细胞突变，从而增加注射的P0代胚胎的成活率，同时P0代成鱼能够有效的传递突变，具有广泛应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类生物工程
，具体涉及一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体及制备方法和用途。
技术介绍
基因编辑技术是揭示基因功能的重要研究工具(Esvelt,K.M.andWang,H.H.(2013).Genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology.MolSystBiol9,641.)。近年来，相继出现的基于核酸内切酶的基因组编辑技术，如：锌指核糖核酸酶(Zinc-fingernucleases,ZFNs)(Bibikova,M.,Beumer,K.,Trautman,J.K.andCarroll,D.(2003).Enhancinggenetargetingwithdesignedzincfingernucleases.Science300,764.)，转录激活因子样效应物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs)(Bedell,V.M.,Wang,Y.,Campbell,J.M.,Poshusta,T.L.,Starker,C.G.,Krug,R.G.,2nd,Tan,W.,Penheiter,S.G.,Ma,A.C.,Leung,A.Y.etal.(2012).Invivogenomeeditingusingahigh-efficiencyTALENsystem.Nature491,114-8.)和ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统(Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.andZhang,B.(2014).Efficientgenetargetinginzebrafishmediatedbyazebrafish-codon-optimizedcas9andevaluationofoff-targetingeffect.JGenetGenomics41,43-6.)，彻底革新了可遗传的定点基因功能缺失研究。与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9系统效率高，而且更容易操作，已成为构建基因敲除动物模型的主要技术。CRISPR/Cas9系统是利用能够特异识别DNA序列的RNA(guideRNA,gRNA)引导核酸内切酶Cas9在基因组的特定位点引入DNA双链断裂，然后细胞的非同源末端修复机制在靶点序列产生随机增减或移码突变，从而达到特异改变靶点遗传信息的目的。在利用CRISPR/Cas9系统制备突变斑马鱼的研究中，研究者们普遍使用体外转录的方法合成核酸内切酶Cas9mRNA，然后将Cas9mRNA注射到斑马鱼胚胎中产生Cas9蛋白。然而目前体外转录技术对实验员的操作技能要求较高，否则会面临合成不出来，或者合成的浓度太低，或者合成的Cas9mRNA存在降解等问题。并且，体外转录出的Cas9mRNA在长期保存过程中，以及每次使用时反复冻存，都会影响保存的Cas9mRNA的质量。除了耗时耗力，体外转录的试剂盒往往比较昂贵。如果建立表达Cas9的斑马鱼转基因品系，就能直接以该品系胚胎为受体，利用胚胎自身表达的Cas9产生切割作用。然而在鱼类中缺乏稳定表达Cas9的品系。另外，在利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，注射靶基因的gRNA和Cas9mRNA后，体细胞的高效突变可以在P0代胚胎中就能进行表型分析(Liu,D.,Wang,Z.,Xiao,A.,Zhang,Y.,Li,W.,Zu,Y.,Yao,S.,Lin,S.andZhang,B.(2014).Efficientgenetargetinginzebrafishmediatedbyazebrafish-codon-optimizedcas9andevaluationofoff-targetingeffect.JGenetGenomics41,43-6.)。然而，如果靶基因是胚胎早期发育必需基因，体细胞的高效突变也将导致胚胎死亡。例如当我们尝试在斑马鱼中制备tcf7l1a基因的突变体时，用较高浓度的tcf7l1a-gRNA和Cas9mRNA注射到胚胎后，85％的胚胎产生严重畸形不能存活下去，而存活的胚胎往往不携带需要的移码突变。如果降低注射剂量以减少突变，虽能减少体细胞的突变使胚胎存活，但也会导致生殖细胞的突变降低，增加后续筛选的难度。因此，对于研制胚胎发育早期的必需基因突变品系，有必要减少体细胞突变以提高胚胎存活率，同时增加生殖细胞突变率以增加突变向后代传递的效率。成体的生殖细胞都是由胚胎发育早期形成的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGC)发育而来(Braat,A.K.,Speksnijder,J.E.andZivkovic,D.(1999).Germlinedevelopmentinfishes.IntJDevBiol43,745-60.)。因此，PGC是胚胎发育阶段唯一能将遗传信息递给子代的细胞类群。作为遗传物质的传递者，鱼类PGC细胞因在早期就能被标记、除去、分离、具有全能性等特点，已成为了鱼类生物工程技术的良好遗传操作对象(Yoshizaki,G.,Takeuchi,Y.andOkutsu,T.(2007).\Germcellinfish:basicbiologyandbiotechnologicalapplications\.TanpakushitsuKakusanKoso52,2067-72.)。如果在胚胎时期特异性提高CRISPR/Cas9系统在PGC中的突变率，就能减少体细胞突变，从而应用于胚胎早期发育必需基因突变体的制备。另外，增加亲代PGC的突变率，即生殖细胞突变率，就能增加子代中突变比例，从而降低制备突变品系过程中筛选突变子代的工作量。在我们之前的研究中，利用转录水平的Gal4/UAS转录激活系统，以mRFP作为报告基因，实现斑马鱼PGC中高效、特异、持续的基因诱导表达调控技术(Xiong,F.,Wei,Z.Q.,Zhu,Z.Y.andSun,Y.H.(2013).TargetedexpressioninzebrafishprimordialgermcellsbyCre/loxPandGal4/UASsystems.MarBiotechnol(NY)15,526-39.)。为了特异性提高CRISPR/Cas9系统在生殖细胞中的突变率，本专利技术在我们之前建立的PGC特异表达KalTA4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于原始生殖细胞靶向突变的转基因载体pTol2(UAS:Cas9)，其序列为SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述转基因载体pTol2(UAS:Cas9)构建方法，包括下述步骤：
1）重组基因片段的获得：
以UAS_F和UAS_R引物对UAS序列进行扩增获得UAS；以Cas9_F和Cas9_R引物对Cas9编码区进行扩增获得Cas9编码区；以nos_F和nos_R引物对nanos33’UTR序列进行扩增获得nanos33’UTR；以UAS，Cas9编码区和nanos33’UTR，这3个DNA片段共同为模板，以UAS_F和nos_R为引物，PCR扩增出由UAS，Cas9编码区和nanos33’UTR这3段DNA分子片段拼接成的重组基因片段，即UAS:Cas9-UTRnos3表达框序列；
UAS_F:TAAACGCGTACTTAGATCTAACTGCAGCGGAGTACT；
UAS_R:CTTGTAATCCATGGTGGCGAATTCGTGTGGAGGA；
Cas9_F:CACGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGACCACGAC；
Cas9_R:CAATGTCCGCTCCGGATCATTTCTTCTTTTTGGCCTGACC；
nos_F:...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊凤，孙永华，叶鼎，朱作言，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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