一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，它是以羧基磁珠为载体，呕吐毒素单克隆抗体为识别中间体，经过活化-偶联-洗涤-封闭的过程制备出偶联有呕吐毒素单克隆抗体的免疫磁珠，在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的呕吐毒素。本发明专利技术用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠具有浓缩待测样品中呕吐毒素浓度、提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品处理时间达到快速检测的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及呕吐毒素样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。
技术介绍
呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，属单端孢霉烯族化合物，是一种由镰刀菌属、头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株产生的代谢产物，具有很强的毒性，可导致动物肠功能紊乱，引起呕吐、腹泻、腹痛等症状，并延缓生长、降低免疫机能。其作为一种天然生物毒素，广泛存在于玉米、小麦、面粉和DDGS等饲料原料及饲料成品中，近年来调查结果显示，我国部分饲料和原料污染霉菌毒素超标的比例高达60％～70％，而呕吐毒素的超标比例接近70％，在配合饲料中的检出率部分高达100％，给人类健康及畜牧业发展造成了很大的危害。我国国家标准GB2761-2011规定在玉米、玉米面(渣、片)及大麦、小麦、麦片、小麦粉中DON的限量为1000μg/kg，GB13078.3-2007规定猪饲料中DON的允许量≤1000μg/kg，联合国粮农组织规定食用粮食中DON的含量必须＜1000μg/kg。目前食品中呕吐毒素的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbead-basedseparation，IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagneticbead，IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。在分离真菌毒素方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。IMB对目的毒素的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。目前，虽有利用免疫磁珠富集分离黄曲霉毒素、T-2毒素的报道，但是免疫磁珠在呕吐毒素上的应用却未见报道。本专利技术利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集呕吐毒素的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对呕吐毒素的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中呕吐毒素的分离与富集，可以进一步提高快速检测呕吐毒素的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决呕吐毒素样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采取的技术方案是：提供一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有呕吐毒素单克隆抗体；所述呕吐毒素单克隆抗体是用呕吐毒素人工抗原免疫白鼠所得到的；所述呕吐毒素人工抗原是呕吐毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：所述呕吐毒素人工抗原是按照如下方法制备得到的：将11mg呕吐毒素半抗原溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将30mg碳化二亚胺(EDC)和30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于0.2mL水后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；将50mg载体蛋白溶于3.8mLPBS缓冲液(pH7.2)中，称为B液；将A液加入到B液中，室温搅拌24h，将得到的产物透析，得到所述呕吐毒素人工抗原。所述呕吐毒素半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：所述呕吐毒素半抗原是按照如下方法制备得到的：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯基丙酸，80℃搅拌12h。停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到呕吐毒素半抗原。本专利技术还提供了一种上述免疫磁珠的制备方法，是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠可与呕吐毒素单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化呕吐毒素的免疫磁珠；上述免疫磁珠的制备方法具体描述如下：(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/LMES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；(3)偶联：将呕吐毒素单克隆抗体溶解到60μLpH5.0、25mmol/LMES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μLpH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％BSA、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN3的TRIS溶液中，2-8℃保存备用。本专利技术同时提供了上述免疫磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠上偶联有呕吐毒素单克隆抗体；所述呕吐毒素单克隆抗体是用呕吐毒素人工抗原免疫白鼠所得到的；所述呕吐毒素人工抗原是呕吐毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠，其特征在于：所述免疫磁珠上偶联有呕吐毒
素单克隆抗体；所述呕吐毒素单克隆抗体是用呕吐毒素人工抗原免疫白鼠所得到的；所述呕
吐毒素人工抗原是呕吐毒素半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于：所述呕吐毒素人工抗原是按照如下方
法制备得到的：
将11mg呕吐毒素半抗原溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，将30mg碳化二亚胺和30mgN-
羟基琥珀酰亚胺溶于0.2mL水后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，称为A液；
将50mg载体蛋白溶于3.8mLPBS缓冲液(pH7.2)中，称为B液；
将A液加入到B液中，室温搅拌24h，将得到的产物透析，得到所述呕吐毒素人工抗原；
所述呕吐毒素半抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
3.根据权利要求1或2所述的免疫磁珠，其特征在于：所述呕吐毒素半抗原是按照如下
方法制备得到的：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯
基丙酸，80℃搅拌12h。停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，

\t除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到呕
吐毒素半抗原。
4.一种权利要求1所述免疫磁珠的制备方法，其特征在于：以粒径2.8μm的羧基磁珠为
载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉梅，罗晓琴，徐念琴，李行，常平平，何方洋，冯才伟，王建霞，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11