半抗原化合物及其多抗、试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种半抗原化合物3-戊二酰基乌头碱，它具有如下结构式(Ⅰ)：本发明专利技术还公开了由上述半抗原化合物与牛血清白蛋白的偶联物免疫新西兰兔获得的多克隆抗体及其试剂盒。本发明专利技术的多克隆抗体及其试剂盒可用于检测双酯型乌头碱。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，特别是涉及一种半抗原化合物及其多克隆抗体、试剂盒与应用。
技术介绍
乌头碱类化合物为二萜型生物碱，依据其结构母核上取代基的不同划分为三类：①双酯型，包括次乌头碱、乌头碱、新乌头碱等，有一定的抗炎镇痛作用，但也是中药材附子毒性的主要源头，其致毒剂量极小，如1-2mg乌头碱即可致人死亡。②单酯型，包括苯甲酰乌头碱，苯甲酰中乌头碱，苯甲酰次乌头碱等，毒性相对较小，有镇痛,抗心律不齐及抗癫痫作用.③无酯型，包括乌头原碱、新乌头原碱等,可抗心律失常，且毒性更低。由此可见，不同的乌头碱类生物碱具有较为相近的生物学活性，但其毒性存在明显差异且与结构密切相关。一方面，乌头碱类生物碱的药效剂量较低，且安全剂量范围相对较窄，临床个体差异对用药的有效与安全影响明显；另一方面，附子的炮制减毒，实际是以水溶去除大部分生物碱和以水解将双酯型生物碱转化为单酯型生物碱的过程，药材来源的差异与炮制过程的控制直接关系到附子的质量评价。因此，对毒性双酯型乌头碱的检测与监控显得极为必要和关键。目前,对附子中乌头碱类生物碱的检测，较为通用的方法是HPLC法及LC-MS法。2010年版中国药典采用HPLC法，分析其中双酯型的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的含量并规定三者的合计含量≤0.02％。然而，乌头碱类生物碱的极性小，检测用色谱条件控制较复杂，且分析时间超长(65min)，极其不便；与此同时，由于检测的药效成分和毒性成份含量均较低，合计含量也仅为万分之二，分析时样品处理、条件控制或人员操作稍有差异或波动，即可带来测定结果的明显偏差。国家法部司法鉴定科学技术研究所则建立以LC-MS法检测生物检材中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量方法和标准，然而，定量LC-MS法对检测设备要求高投入大，难以普遍推广应用，而且对检测样品的预处理也极为繁琐。因此，对附子中活性及毒性乌头碱类生物碱的有效监控需要研究开发更简便、更灵敏、更可靠的检测方法。免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高度特异性及敏感性而建立起来的一种生物分析法，相比传统色谱方法，它对于微量痕量成分的准确快速检测具有无法比拟的技术优势：样品的预处理简单、准确度极高、灵敏度高，检测限度可达ng甚至pg级，检测时间仅需3-5min，适合样品的现场即时监控以及大批量样品的快速分析。利用抗体开展对微量痕量中药成分的定性定量分析、中药成分的体内药代动力学研究已逐步得到应用，具体方法有亲和色谱法、免疫色谱法、免疫印迹法等。虽然抗体-免疫分析方法的研发，先期投入较大技术要求较高，但一旦研发成功，可形成特征性抗体的工程菌株，为专有技术，不仅寻求专利保护，而且还可以由此开发出如酶联免疫检测试剂盒等市场应用型的产品，因而具有良好的应用前景和市场开发价值。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种能够特异性识别双酯型乌头碱的多克隆抗体及其试剂盒与应用。具体地说，本专利技术的第一方面是提供了一种半抗原化合物3-戊二酰基乌头碱，其特征在于，它具有如下结构式(Ⅰ)：本专利技术的第二方面是提供了一种双酯型乌头碱的多克隆抗体，可由半抗原与牛血清白蛋白的偶联物免疫新西兰兔获得，所述半抗原为具有如下结构式(Ⅰ)的3-戊二酰基乌头碱：在一优选例中，所述3-戊二酰基乌头碱可经由以下方法制得：(1)称取乌头碱50mg、戊二酸酐8.8mg以及吡啶2mL反应20h，用3ml冰水终止反应后，用3倍量的乙酸乙酯萃取3次，减压蒸干反应物；(2)用SephadexLH-20柱层析纯化步骤(1)所得的反应物，以甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行洗脱，收集流出液，减压蒸干即得。本专利技术的第三方面是提供了上述多克隆抗体在检测双酯型乌头碱中的应用。本专利技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述双酯型乌头碱的多克隆抗体。本专利技术的双酯型乌头碱多克隆抗体，具有如下优点：1.本专利技术的双酯型乌头碱多抗可以稀释80000倍使用，从而降低了成本；2.本专利技术的双酯型乌头碱多抗的检测限为250pg，灵敏度较高；3.本专利技术的双酯型乌头碱多抗特异性强，与单酯型乌头碱的交叉反应均小于8％，而与去甲乌药碱无交叉反应。本专利技术各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本专利技术的特点、目的和优势将更为明显。附图说明图1为半抗原(AC-GS)的ESI-MS图谱。图2为半抗原(AC-GS)的1H-NMR图谱。图3为半抗原(AC-GS)的HMBC二维谱。图4为半抗原(AC-GS)的HSQC二维谱。图5为半抗原(AC-GS)的13C-NMR图谱。图6牛血清白蛋白的MALDI-TOFMS图谱(分子量66431.1Da)。图7乌头碱免疫抗原的MALDI-TOFMS图谱(分子量79724.3Da)。图8双酯型乌头碱检测试剂盒的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件(其中，乌头碱对照品购自成都曼斯特生物公司；N,N’-二环乙基碳化亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、TMB、牛血清白蛋白(BSA)以及卵清白蛋白OVA等均购自美国Sigma公司；其他化学试剂均符合分析标准；新西兰大白兔2只，雄性，每只体重2.5kg)。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本专利技术提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。实施例1半抗原—3-戊二酰基乌头碱(AC-GS)的制备及鉴定1.称取乌头碱50mg、戊二酸酐8.8mg、吡啶2mL反应20h，用3ml冰水终止反应后，用3倍量的乙酸乙酯萃取3次，减压蒸干。2.反应物用SephadexLH-20柱层析纯化,以甲醇/二氯甲烷为洗脱液，收集流出液，减压蒸干得纯品。3.经过ESI-MS、13C-NMR、1H-NMR、HMBC、HSQC二维谱鉴定式Ⅰ化合物化学结构。ESI-MS测定仪器：M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半抗原化合物3‑戊二酰基乌头碱，其特征在于，它具有如下结构式(Ⅰ)：

【技术特征摘要】
1.一种半抗原化合物3-戊二酰基乌头碱，其特征在于，它具有如下结构式(Ⅰ)：
2.一种双酯型乌头碱的多克隆抗体，由半抗原与牛血清白蛋白的偶联物免疫新西兰兔后
获得，其特征在于，所述半抗原为具有如下结构式(Ⅰ)的3-戊二酰基乌头碱：
3.如权利要求2所述的多克隆抗体，其特征在于，所述3-戊二酰基乌头碱可经由以下方
法制得：
(1)称取乌头碱50mg、戊二酸酐8.8mg以及吡啶2mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：华茉莉，许玉，黄磊，徐云辉，袁帅，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31