本发明专利技术公开了一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，以氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶。本发明专利技术首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶应用于不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶中，其对底物的转化率高达99.34%，产物的对映体过量值为100%。反应体系简单、底物浓度高、高底物浓度的催化反应无需分批投料，具有重要的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药和生物化工
，具体涉及一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法。
技术介绍
哌啶酮及其衍生物是非常重要的哌啶同系物，利用哌啶酮结构中的羰基的活性可以引发许多有机反应。其衍生物已经被发现具有抗菌、抗肿瘤、治疗老年痴呆症和麻醉等多种药理活性，同时也是治疗病毒感染(包括AIDI)及糖尿病的重要药物之一(Shen,W.,etal.,Synthesisof(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine.ChineseJournalofPharmaceuticals,2013.44(5):p.436-438.)。以(S)-N-boc-3-羟基哌啶为例，(S)-N-boc-3-羟基哌啶可以用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林(Carpino,P.A.,etal.,Pyrazolinone-piperidinedipeptidegrowthhormonesecretagogues(GHSs):Discoveryofcapromorelin.Bioorganic&MedicinalChemistry,2003.11(4):p.581-590.)、BTK抑制剂ibrutinib(Advani,R.H.,etal.,BrutonTyrosineKinaseInhibitorIbrutinib(PCI-32765)HasSignificantActivityinPatientsWithRelapsed/RefractoryB-CellMalignancies.JournalOfClinicalOncology,2013.31(1):p.88-94.)、天然物质异白刺啉淋胺(isonitramine)和小果白刺碱(sibirine)等药物前体(Snider,B.B.andC.P.Cartayamarin,TOTALSYNTHESISOF(+/-)-NITRAMINE-DEVELOPMENTOFAKETENEEQUIVALENTINTHEENEREACTION.JournalOfOrganicChemistry,1984.49(10):p.1688-1691.)，因此该化合物具有广泛的应用前景。迄今为止，关于(S)-N-boc-3-羟基哌啶的合成已进行了很多的研究报道。主要分为化学转化法和生物催化法。化学转化的方式因其催化剂价格昂贵、反应条件苛刻、收率低、合成步骤繁琐，并且产生的三废较多，没有能够实现工业化应用(Reddy,A.S.,M.Narender,andK.R.Rao,Anewasymmetricsyntheticroutetosubstitutedpiperidines.Tetrahedron,2007.63(2):p.331-336.)。生物催化法不对称还原N-boc-3-哌啶酮制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的技术有一定进展。Lacheretz等(Lacheretz,R.,D.G.Pardo,andJ.Cossy,DaucuscarotaMediated-ReductionofCyclic3-Oxo-amines.OrganicLetters,2009.11(6):p.1245-1248.)利用胡萝卜组织细胞还原N-boc-3-哌啶酮制备出95％光学纯的(S)-N-boc-3-羟基哌啶。该反应由于催化剂来源不稳定底物浓度低(3mM)、催化剂使用量大(23％,m/v)、收率低(73％)且光学纯度较低(95％ee)，不具有工业应用价值。XinJu等(Ju,X.,etal.,DevelopmentofaBiocatalyticProcesstoPrepare(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine.OrganicProcessResearch&Development,2014.18(6):p.827-830.)筛选到了一条依赖于NADH的酮还原酶，在大肠杆菌表达，并添加适量的辅酶NAD、辅底物异丙醇及适量助溶剂IPA后，利用底物耦合的辅酶循环系统，分批添加总量为5g的底物，在50ml的水相反应体系中经过24h反应，摩尔转化率达到99.8％，(S)-N-boc-3-羟基哌啶收率和化学纯度分别为97.6％和93％。虽然该方法产物光学纯度不高，但是可以确定利用先进的重组酶技术能够开发出具备工业化参数标准的(S)-N-boc-3-羟基哌啶生物催化制备工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，首次将NCBI上的收录号为AGG35486.1的醇脱氢酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶，转化率高，产物光学活性高，大大降低了生产成本。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，以氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶。反应体系中，N-boc-3-哌啶酮的浓度为15～220g/L，醇脱氢酶活性为5.6U/(mgprotein)，用量为60U～6000U。反应条件为pH6.0～7.5、20～35℃、180～280rpm条件下反应1～12h。优选反应条件为pH7.0、30℃、200rpm条件下反应6h。所述NADH辅酶体系为NAD+的浓度为0.05～0.5mmol/L，异丙醇13.5～198g/L。所述NADH辅酶体系为NAD+、甲酸钠和甲酸脱氢酶混合体系。所述NADH辅酶体系为NAD+、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶混合体系。所述的醇脱氢酶是通过表达含有基因序列如SEQIDNO：1所示的重组菌得到的。本专利技术中涉及到的还原酶是醇脱氢酶，其包含336个氨基酸，其在NCBI上的收录号为：AGG35486.1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。编码该蛋白的基因含有1011bp碱基，其在NCBI中的收录号为KC236900.1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。至今未发现该酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶醇的报道。本专利技术中所用催化剂为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的醇脱氢酶，可以以任意形式参与反应，比如，将基因导入到受体菌中表达得到醇脱氢酶参与反应，或者直接将发酵后的菌泥参与反应。将基因序列如SEQIDNO：1所示的醇脱氢酶诱导表达后，与15～220g/L的N-bo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶法不对称还原制备(S)‑N‑boc‑3‑羟基哌啶的方法，其特征在于：以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N‑boc‑3‑哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)‑N‑boc‑3‑羟基哌啶。
【技术特征摘要】
1.一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：以氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶。
2.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：N-boc-3-哌啶酮的浓度为15~220g/L，醇脱氢酶活性为5.6U/mg蛋白，用量为60U~6000U。
3.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：反应条件为pH6.0~7.5、20~35℃、180~280rpm条件下反应1~12h。
4.根据权利要求1所述的酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，其特征在于：所述NADH辅酶体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：严明，章志林，魏淼，陈晶晶，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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