本发明专利技术公开了一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。所述的引物组合物由SEQ ID NO.2所示的正向外引物CYP51C-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物CYP51C-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物CYP51C-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物CYP51C-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物CYP51C-LF，SEQ ID NO.7所示的环引物CYP51C-LB组成。本发明专利技术解决了现有黄色镰孢菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性偏低的问题，所需检测时间短(仅需85min)、特异性强、灵敏度高、可肉眼观察检测结果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，设及一种检测黄色镶抱菌的环介导等溫扩增引物组合 物及其应用。
技术介绍
大豆根腐病是一种由多种病原菌引起的，造成大豆根部及茎基部腐烂的病害的通 称。其分布广、危害重、病原物种类多达十几种且所致病害症状不易区别，防治困难，是大豆 生产中最严重的病害之一。大豆镶抱根腐病是由镶抱属真菌引起的大豆根腐病，于1917年 由美国的化ommell首次报道目前已经在中国W?、美国m、印度、菲律宾及日本等国报 道发生，是我国东北和黄淮海地区大豆产区的重要病害。大豆镶抱根腐病在大豆整个生育 期均可发病，感病植株首先从根尖开始变色，初期呈水浸状，然后变成褐色，病株的根W及 茎基部产生褐色楠圆形、长条形至不规则形凹陷斑，并逐渐扩展成环绕主根的大斑块，有时 还会为害侧根。病菌主要为害表皮及皮层，使其变黑坏死，有时根和茎的中下部维管束变为 淡褐色，在潮湿条件下，病部表皮会有白色或粉红色霉层，严重时主根下半部全部烂掉，造 成整株死亡。幼苗期主根病斑呈红褐色、铁诱色或黑褐色，重病株的主根和须根腐烂，造成 "秀根";成株期病株根部形成褐色斑，病重时根系开裂，植株的地上部叶片由下而上逐渐发 黄，感病植株有矮化现象；花期和芙期为发病高峰期，此时发病，根系腐烂，田间出现大量黄 叶，病株矮化，结芙少，巧粒小并且产量严重降低W1U。近年来，该病的发生呈现扩大蔓延、 加重危害的趋势，对大豆生产造成很大威胁。 迄今为止，我国已报道的可W引起大豆镶抱根腐病的病原菌有：尖镶抱菌 (F'usariumoxysporum)、茄腐镶抱菌（F.solani)、木贼镶抱菌（F.equiseti)、禾谷镶抱菌 化graminearum)、层出镶抱菌化proliferatum)、Ξ线镶抱菌化tricinctum)、燕麦镶抱 菌化avenaceum)、半裸镶抱菌化semitecteum)、轮枝镶抱菌化ve;rticillioides)等 1S3。魏巍等M3结合DGGE条带克隆测序及系统发育分析从大豆根腐病样本中鉴定到黄色 镶抱菌（F.culmorum)，我们也从发生根腐病的大豆植株上分离到了黄色镶抱菌。由于镶抱 菌常在大豆植株上发生复合侵染，而且依据形态特征不易鉴别，因此针对黄色镶抱菌的快 速分子检测，我们进行了一系列的研究。 黄色镶抱菌是非常重要的引起谷类根腐病和赤霉病的±传真菌M。黄色镶抱菌 可W侵染小麦引起小麦赤霉病M、小麦根腐病，侵染玉米引起玉米穗腐病，还能寄生于 黄春菊、翠菊、甜椒、番茄、四季豆、矮芙菜豆等。该菌广泛分布于世界各地，许多欧洲国家、 澳大利亚都有发生，我国的青海M、甘肃M、山西及黄淮海地区都有发生。黄色镶抱 菌在25°C条件下，PDA培养基上培养3d后，菌落直径达90mm，气生菌丝絮状而茂盛，表面浅 黄色，后期产生紫红色色素；用1%CMC培养基摇菌（25°C，120巧m)，5d后产生大量大型分 生抱子?，长镶刀形，中上部膨大弯曲，顶细胞渐尖，足细胞不明显，3-5分隔，无小型分生 抱子。黄色镶抱菌可产生T-2,脱氧雪腐镶抱菌締醇值0脚，雪腐镶抱菌締醇（NIV)，玉米締 酬狂ΕΝ)和玉米赤霉締酬狂OH)等毒素E223,能引起人畜中毒。 传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、 灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰^ 23^，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断， 很难对病害发生进行及时的监测和有效的控制。近年来，分子生物学技术如普通PCR的方 法已逐步应用到各种病原菌的研究中。但如今，普通PCR已经是陈旧的技术且具有很多缺 陷，例如检测耗时偏长，对祀基因区段识别位点较少，误检率偏高，检测特异性与灵敏度偏 低，检测过程较繁琐等。环介导等溫扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本 的荣研株式会于2000年专利技术的一种新的核酸扩增技术EW，因为其操作简单、快速、特异性 高、成本低等优点，成为可W替代普通PCR的核酸扩增技术。它是针对祀基因的6个区域设 计4条特异性的引物，在链置换DNA聚合酶度stDNApolymerase)的作用下引起自循环链 置换反应，经过60~65°C恒溫扩增30~85min，就能大量合成目标DNA。LAMP的反应产物 可通过浊度仪观测，反应后加入SYBRGreenI或反应前加入HNB(^基糞酪蓝）等方法，来 判断结果。HNB是金属离子Mg2+的滴定剂，其颜色随着反应液的抑变化而变化，因此可W 通过检测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液抑而起到颜色指示剂的作用。阳性样品 溶液颜色由紫色变为天蓝色，阴性样品溶液颜色保持紫色不变。由于LAMP扩增过程依赖识 别祀序列6个独立区域，所W反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒溫条件下进行，普 通的水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，因此检测成本大大降低。 祀标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的祀标基因，如核糖 体基因转录间隔区（Internaltranscribedspace, 口巧口5]不能在种的水平上准确的区分 镶抱菌属真菌。通过查找相关文献，选取多种在种内保守、种间存在丰富变化的潜在的祀标 基因。本专利技术最终将黄色镶抱菌的CYP51C特异区段作为祀标基因序列，设计筛选了四条特 异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物，并在此基础上建立了基于颜色判定的简便、 快速和灵敏的黄色镶抱菌的LAMP检测体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种检测黄色镶抱菌的环介导等 溫扩增引物组合物。 本专利技术的另一目的是提供该引物组合物的应用。 本专利技术的又一目的是提供一种检测黄色镶抱菌的LAMP试剂盒。 本专利技术的目的可通过W下技术方案实现：[001引一种用于LAMP检测黄色镶抱菌的引物组合物，由SEQIDNO. 2所示的正向外引 物CYP51C-F3,沈QIDNO. 3所示的反向外引物CYP51C-B3,沈QIDNO. 4所示的正向内引 物CYP51C-FIP，沈QIDNO. 5所示的反向内引物CYP51C-BIP，沈QIDNO. 6所示的环引物 CYP51C-LF，SEQIDNO. 7 所示的环引物CYP51C-LB组成。 本专利技术所述的引物组合物在检测黄色镶抱菌中的应用。 本专利技术所述的引物组合物在制备黄色镶抱菌检测试剂中的应用。 一种用于检测黄色镶抱菌的LAMP试剂盒，包含本专利技术所述的引物组合物。[001引 所述的LAMP试剂盒优选包含：2. 5μL10XThermo化1Buffer，8mMΜ拆04， 1. 2mMdNTPs，内引物FIP和BIP各1. 6μM，外引物F3和B3各0. 4μM，环引物LF和LB各0.8μM，0.8M甜菜碱，0.1%Trion-X，20mMTris-肥l(PH8.8)，10mMKCl，10mM(NH4)S04， SU·wLiBstDM聚合酶，ISOmMHNB组成的检ii溶液。 一种LAMP检测黄色镶抱菌的方法，包括取24μL所述的检测溶液，加入2μL待检 DM溶液，总体积为26μL进行LAMP反应；反应程序为：62°C，85min;反应后观察溶液颜色 变化，如果反应管变为本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ ID NO.1所示的CYP51C基因序列作为检测靶标在检测黄色镰孢菌中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑小波，曾丹丹，田擎，张海峰，王源超，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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