静默EGFR表达的脱氧核糖核酸酶制造技术

本发明专利技术提供脱氧核糖核酸酶，其能在对偶基因专一性的层级静默EGFR表达。这些抗EGFR T790M突变的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶，使EGFR T790M mRNA的表达减量(knockdown)同时维持EGFR野生型mRNA的完整性。因此，这些抗EGFR T790M突变的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶可克服T790M驱动的TKI抗药性并且伴随降低在肺癌病患的正常细胞中不希望的副作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及静默EGFR表达的脱氧核糖核酸酶值NAzyme)。特定言之，本专利技术设及 一种专一性杂交至EGFRT790MRNA寡核巧酸。
技术介绍
表皮生长因子受体巧GFR)是一个表达于表皮的表面的穿膜蛋白，其在表皮修复 与再生上扮演重要的生理作用。表皮生长因子巧G巧为唾腺或其他与表皮表面相关腺体所 分泌的多肤，其与EGFR的细胞外域的特定区域结合。结合后，其产生一向细胞内传导的讯 息。第一个由于EGF结合导致的细胞内事件为EGFR细胞内域的构型改变，其使得5' -Ξ 憐酸腺巧（AT巧进入所谓的酪胺酸激酶（TK)域（其为一个含有酪胺酸残基的袋部），并 且贡献一憐酸基团至所述酪胺酸残基。所述带有憐酸化酪胺酸的细胞内EGFR变成能够 与其他细胞内蛋白质连结，并且能够启动一系列生化反应，其通过非常复杂的网络传导至 下游。此网络当中最为熟知的部分为活化后会导致癌细胞分裂的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)路径，W及活化后会增进细胞存活的AKT路 径。因此，EGFR活化的结果为增强细胞增生及强化细胞对不同干扰的耐受度。相较于邻近 正常细胞或其所源自的表皮表面，许多肿瘤过度表达EGFR或有突变型的EGFR，使其内在地 活化或具有对活化较强的感受性。此过度表达被认为是肿瘤细胞获得生长优势的许多机制 之一，其中获得生长优势是一恶性肿瘤表达型的特征。因此，阻断EGFR路径被认为是治疗 人类恶性肿瘤的合理策略。有两个基本的方法来抑制上游EGFR讯息路径：（1)通过利用专 一性的单株抗体从而避免EGF与其他天然肤配体结合至细胞外EGFR域，及（2)通过利用结 构上与袋部非常契合的小分子（亦即EGFR酪胺酸激酶抑制剂如gefitinib与erlotinib) 从而避免ATP与其他憐酸提供者进入细胞内EGFR域的酪胺酸激酶口袋。 肺癌是癌症相关死亡的主要成因，且在当中非小细胞肺癌（NSCLC)占约85%。在 独特的NSCLC病患次群组中，肺癌细胞在EGFR带有活化性突变且惯常于异常EGFR讯息传 导的细胞存活。活化性突变中，EGFR的L858R突变与LREA剔除造成超过90 %的药物敏感 性突变，并且相较于野生型EGFR，对酪胺酸激酶抑制剂（TKI)有较强的结合亲合力。TKIs 的施用成功诱发EGFR突变的肺癌细胞内在的细胞调亡路径；但是，正常细胞的野生型EGFR 讯息的同步抑制作用，无可避免地引发剂量-限制性的副作用；例如皮肤红疹与腹泻。此 夕b尽管TKI在NSCLC-开始时的治疗上成功，在EGFR守口员残基790所导致的继发突变 灯790M，在50%抗药性病人当中可W发现），减弱TKI与EGFR之间的交互作用。剂量限制 毒性与T790M衍生的抗药性仍是NSCLC治疗上主要的待解决议题。核糖核酸酶（r化ozymes)是自然存在的RNA分子，其含有使其较反义寡核巧酸有 效力的催化位置。然而，核糖核酸酶的更广泛用途由于其对化学性与酵素性降解的易感受 性及受限的目标位置专一性而受到阻碍。新一代的催化性核酸已被描述，其包含具有对特 定RNA序列有催化活性的DNA分子。相较于键头形的核糖核酸酶，此等DNA酶具有较佳的 催化效率（产生相较于自发性RNA分裂（RNAcleavage)速率快约1亿倍的速率增强），提 供较佳的受质专一性，对化学性与酵素性降解较有抗性，且其合成更为便宜。通过合理化设 计，能作用在特定mRNA使得基因的表达静默在转录子或对偶基因特定层级的核酸剂已被 全球许多实验室使用多年。在其当中，脱氧核糖核酸酶已被广泛地研究，W极佳结果静默多 种基因而作为治疗药剂。脱氧核糖核酸酶的基本结构是由两个受质结合臂侧翼于一催化域 组成，其中受质结合臂的序列与目标mRNA序列互补。脱氧核糖核酸酶在mRNA分裂位点对不 同的核巧酸组合物呈现不同的反应速率。此外，有别于需要切下酶（Dicer)蛋白从而形成 RNA诱发静默复合体巧ISC)来进行RNA分裂的siRNA，细胞质中富含的二价金属离子例如 Μ护或化2+足W催化脱氧核糖核酸酶的功能。结合运些因素，脱氧核糖核酸酶是便宜、稳定、 及易操作的核酸剂，且其有高效率的RNA分裂活性及在癌症治疗中具有低的非专一毒性。GaryBeale等人提供一些核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶在Α431细胞中抑制EGFR 的表达（JournalofDrugTargeting,August2003V〇1. 11(7),卵.449 - 456)。然而，所述 先前技术指出运些核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶在抑制的效力上有较差的效果。化ispin R.化SS等人发表了记载脱氧核糖核酸酶在对抗癌症领域中兴起的回顾文章，其作为本文所 提及具前景的生物技术的预测（MolCancerTher2008 ;7(2) :243 - 51)。US20120225870 掲示一抗化bB或抗MET治疗可W是酵素性核酸例如核糖核酸酵素、催化性RNA(catalytic RNA)、酵素性RNA(emzymaticRNA)、催化性DMkatal}fticDM)、适体（aptamer)或适 体结合核糖核酸酶（aptamer-bindingribozyme)、可调节性核糖核酸酶（regulat油le ribozyme)、催化性寡核巧酸katal}fticoligonucleotides)、核酶（nucleozyme)、脱氧核 糖核酸酶值NAzyme)、RNA酵素（RNAenzyme)、核糖核酸内切酶（endoribonuclease)、核酸内 切酶（endonuclease)、微酶（minizyme)、引导酶（lea化yme)、寡酶（oligozyme)或DNA酵素 值NAenzyme)。然而，没有实质上酵素性核酸在此参考文献中提出。 仍有发展能有效静默EGFR表达或克服TKI抗性且伴随较低有害副作用的脱氧核 糖核酸酶的需求。
技术实现思路
本专利技术提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR突变 mRNA从而抑制其转译。 本专利技术提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRT790M mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有选自由SEQIDN0:1至7组成的群的序 列的连续核巧酸。 本专利技术更提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR E746-A750缺失的mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有SEQIDN0:8的序列 的连续核巧酸。 本专利技术更提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR L858RmRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有选自由SEQIDNO: 9至15组成的 群的序列的连续核巧酸。 本专利技术也更提供一种载体与宿主，其包含编码本专利技术的寡核巧酸或其修饰序列的 序列的载体。 本专利技术也提供一种医药组合物，其包含本专利技术的寡核巧酸或其修饰序列、载体或 宿主及医药上可接受的载剂。 本专利技术也更提供一种专一性地分裂EGFR突变mRNA或抑制EGFR突变mRNA表达的 方法，其包含使本专利技术的寡核巧酸或其修饰序列在容许所述分子分裂所述mRNA或抑制所 述mRNA表达的条件下接触所述mR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡核苷酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR突变mRNA从而抑制其转译。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨泮池，赖薇云，白果能，
申请(专利权)人：中央研究院，杨泮池，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71