低聚糖偶联物和使用方法技术

提供了一种检测样品中的抗M和/或抗A和/或抗C/Y抗体的存在的方法，所述方法包括：将样品与根据本发明专利技术所提供的诊断偶联物接触，包括包含有至少两个单元的4,6-二去氧-4-酰氨-α-吡喃糖并包含相邻的4,6-二去氧-4-酰氨-α-吡喃糖单元之间的至少一个-(1-3)-连接的低聚糖，其中，吡喃糖的碳5位连接着R基团，R独立地选自‐CH2OH,‐H或具有至少一个C原子的烷基，低聚糖共价连接到非糖分子或到表面。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低聚糖偶联物和使用方法
本专利技术涉及一种新型的包含低聚糖的诊断偶联物，其作为一种可靠的诊断可用于检测布鲁氏菌病。此外，这些检测能够提供一种DIVA(从接种疫苗的动物中鉴别出被感染的)检测，用于本文另外公开的接种的新型疫苗偶联物。
技术介绍
布鲁氏菌病是一种严重的跨国界全球性人畜共患病，其通过牲畜和野生动物传播，并主要是由于感染羊种布鲁氏杆菌或猪种布鲁氏杆菌3型。虽然该疾病在人体中影响非常严重，人与人之间的传播是罕见的，并且几乎所有病例都是由于接触了受感染的动物或动物产品(Francoetal.(2007)TheLancetInfectiousDiseases7,775-786)。布鲁氏菌病(除了犬种布鲁氏杆菌以外)是由于感染了布鲁氏杆菌光滑菌株，这些菌株的O-多糖(OPS)在其外膜上作为光滑的脂多糖(sLPS)的一部分(Cardosoetal(2006)MicrobialCellFactories5,13)。所述sLPS是一种大分子，包括具有氨基葡萄糖主链的脂质A，所述氨基葡萄糖主链连接于一组核心糖，在布鲁氏杆菌的光滑菌株的情况下，该核心糖连接至所述OPS，其延伸到细胞外环境。所述OPS被认为并被确定为致病因子(Porteetal.(2003)InfectionandImmunity71,1481-1490)，并且诱导宿主内很强的抗体应答，其为古典和现代血清学诊断检测所针对的(Nielsen&Yu(2010)Prilozi31,65-89)。不幸的是，其它具有类似OPS结构的革兰氏阴性细菌的感染，可能是种系发生无关的，可能会产生抗体，其在古典和现代血清学诊断检测中发生交叉反应(Corbel(1985)Vet.Bull.55,927-942)。这样的假阳性血清反应(FPSRs)变得特别有问题，在布鲁氏菌病零患病率的区域，其中血清检测的阳性预测值变得非常小。改进布鲁氏菌病血清诊断特异性的尝试，主要是围绕着识别和应用重组蛋白抗原而努力。尽管许多研究已经发表以推崇一种或另一种抗原对假阳性分辨率的优点，没有一种研究结果成功地实现了已经渐渐超越了实验室研究而进入常规和有效利用的检测。引发的抗体是由于感染小肠结肠炎耶尔森菌，显著的与源自布鲁氏杆菌的光滑菌株的OPS以0:9的交叉反应，由于它们的结构具有相当大的相似性(McGivenetal.(2008)JournalofImmunologicalMethods337,7-15)并在诊断测试中被认为会导致许多假阳性血清反应(Gerbieretal(1997)VetRes28,375-383)。类似地，引发的针对源自布鲁氏杆菌的光滑菌株的OPS的抗体，表现出对小肠结肠炎耶尔森菌O：9OPS相当大的反应(Jungersenetal.(2006)EpidemiolInfect134,347-357)。所述布鲁氏杆菌OPS是无支链的可变长度的均聚物，平均由50-100单元的4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-D-吡喃甘露糖(N-甲酰基佩鲁斯胺)稀有糖构成(Meikleetal(1989)InfectImmun.57，2820-2828)。所述4,6-二脱氧15-4-甲酰胺基-D-吡喃甘露糖单元自身只在自然界中发现了布鲁氏杆菌有机体和小肠结肠炎耶尔森菌O：9的OPS结构。在几乎所有的布鲁氏杆菌有机体中，相邻的4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-D-吡喃甘露糖单元为可变地-1,2或-1,3键连接。结构数据表明，只有区分布鲁氏杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌O：9OPS的-1,3键连接，是因为后者是一种专属的α-1,2连接的4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-D-吡喃甘露糖的均聚物(Caroffetal.(1984)Eur.J.Biochem.139，195-200)。在布鲁氏杆菌菌株之间，α-1,2连接的比例在2％-20％之间(Meikleetal.(1989)Infect.Immun.57,2820-2828)。即使是在具有20％的-1,3连接的布鲁氏杆菌菌株中，该OPS会包含许多相邻的-1,2连接(Bundleetal.(1987)Biochemistry26,8717-8726)。然而，目前还不知道，这些连接的序列是否是有序和整齐的。有三种主要的生物合成OPS的途径，Wzx/Wzy，ABC(Wzm/Wzt)和合成酶系统(Wangetal(2010)In“Endotoxins:structure,function&recognition”；SpringerNetherlands,pp.123-152)。布鲁氏杆菌利用ABC系统(Gonzalezetal(2008)PLoSONE3，e2760)，由于其在具有均聚OPS的有机体中更常见(包括小肠结肠炎耶尔森菌O：9)。在此途径中，糖类被单独地添加到不断增长的OPS链，而非被构造成重复单元然后再加入，就如在Wzx/Wzy路径中的例子一样，其中，OPS经常由三到五个不同的单糖的重复块构成。像这样，很可能的是，α-1,3连接的位置没有规律性，并且它们随机地分布在延长的相邻α-1,2连接的区域，甚至是在具有相对高比例的α-1,3连接的菌株中。合成OPS的酶的控制和保真度尚未确立。两种连接类型的比例影响OPS的形状，并且不同的形状是单克隆抗体(Douglasetal(1988)JClinMicrobiol26,1353-1356)和多克隆抗体可识别的，比如那些用于对布鲁氏杆菌进行血清分类为A(α-1,3键连接相对低一些，通常为2％)和M(α-1,3键连接相对高一些，通常为20％)优势菌株或血清型(Altonetal(1994)TechniquesfortheBrucellosisLaboratory,pages53-54；INRAEditions,ISBN-10:2738000428)。猪种布鲁氏杆菌2型菌株(Zaccheusetal.(2013)PLoSOne8,e53941)和小囊耳2O型菌株(Wattametal.(2012)mBio3:00246-12)似乎不包含任何α-1,3连接。小囊耳2O型菌株是一种极不寻常并且是所述布鲁氏杆菌属的远亲成员，也是极为罕见的。虽然，它是光滑菌株，但是它缺乏所需要的合成4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-D-吡喃甘露糖OPS的大多数基因(Wattametal(2012)mBio,3:5)。它的OPS结构是一种还没有被确定的不同的形式。在布鲁氏杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌0：9均聚的OPS中，α-1,2和α-1,3连接的相对比例和分布创建不同，但是，不必全面描述，抗体结合抗原决定簇。在布鲁氏杆菌中，有三种不同的抗原抗原决定簇，其可以在OPS中找到，为此，出现了坚固结构的证据(Bundleetal.(1989)Infect.Immun.57,2829-2836)，见表1：表1-OPS抗原决定簇专有地α-1,2连接的三糖和四糖序列，被发现在OPS中含量丰富，此OPS指源自流产羊种和猪种布鲁氏杆菌以及小肠结肠炎耶尔森菌O：9。这种序列被称为“C/Y抗原决定簇”，因为在经济上重要的布鲁氏杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌O：9的所有光滑菌株内，它们是常见的。结合这些序列的单克隆抗体被称为抗C/Y。被专属地α-1,2连接的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中的抗M和/或抗A和/或抗C/Y抗体的存在的方法，所述方法包括：将样品与一种诊断偶联物相接触；所述诊断偶联物包含有至少两个单元的4,6‑二去氧‑4‑酰氨基‑α‑吡喃糖并包含相邻的4,6‑二去氧‑4‑酰氨基‑α‑吡喃糖单元之间的至少一个‑(1‑3)‑连接的一种低聚糖，其中的所述吡喃糖中的5位上的C连接着R基，所述R基独立地选自‑CH2OH,‑H或具有至少一个C的烷基；所述低聚糖被共价连接到非糖分子或成坚固实体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.16 GB 1306882.0;2013.04.16 US 61/812,402;21.一种检测样品中的抗布鲁氏杆菌抗M抗体的存在的方法，所述方法包括：将样品与一种诊断偶联物相接触；所述诊断偶联物包含由2或3或4个单元的4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖组成的低聚糖并在相邻的4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖单元之间包含至少一个-(1-3)-连接；其中，吡喃糖中5位上的C连接着R基，所述R基独立地选自-CH2OH，-H或具有至少一个C的烷基；所述低聚糖被共价连接到非糖分子或成坚固实体。2.一种根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低聚糖仅仅包含一个-(1-3)-连接。3.一种根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低聚糖是式I所示的二糖：4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-3)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖(式I)。4.一种根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低聚糖包含式Ⅲ或式Ⅳ所示的三糖：4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-3)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-2)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖(式Ⅲ)；4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-2)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-3)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖(式Ⅳ)。5.一种根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低聚糖包含式Ⅶ所示的四糖：4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-2)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-3)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基-(1-2)-4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖(式Ⅶ)。6.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，在所述低聚糖中的每个4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖单元中的所述酰氨基独立地选自：甲酰氨基，乙酰氨基，丙酰氨基或丁酰氨基。7.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，至少一个4,6-二脱氧-4-酰氨基-α-吡喃糖基单元是4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-α-D-吡喃甘露糖基。8.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，所述非糖分子为一种蛋白质，或为一种包括疏水部分或荧光基团的非蛋白质载体分子。9.根据权利要求8所述的一种方法，其特征在于，所述非糖分子为牛血清白蛋白(BSA)。10.根据权利要求1所述的一种方法，其特征在于，所述低聚糖通过一种蛋白质键合连接至一种坚固实体。11.根据权利要求10所述的一种方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·麦克吉文，大卫·邦德，劳伦斯·豪厄尔斯，朱莉·吉亚尔，维吉雅·伽内什·那罗亚纳斯瓦密，
申请(专利权)人：环境，食品及农村国务部，阿尔伯塔大学董事会，
类型：发明
国别省市：英国;GB