本发明专利技术涉及一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：(1)将巨大芽孢杆菌经活化后，接种于固体培养基上，静置培养，得二次活化后的巨大芽孢杆菌；(2)将二次活化后的巨大芽孢杆菌接种于种子培养基中，发酵培养，制得种子菌液；(3)将种子菌液接种于发酵培养基中，发酵培养，添加补料液，继续发酵，制得巨大芽孢杆菌发酵液；本发明专利技术通过对培养条件及培养基成分的选择，同时在发酵的过程中添加巨大芽孢杆菌的芽胞化促进剂，提高了巨大芽孢杆菌活菌数和芽孢率，制得的发酵液中活菌数可以达到8.0×109CFU/ml以上，经结晶紫染色后油镜观察，芽孢率95％以上，可显著提高产品的芽孢数和产品质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于微生物发酵工程
技术介绍
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为革兰氏阳性菌，是一种植物根系促生细菌，也是微生物肥料中的常用菌种。巨大芽孢杆菌可以用来生产解磷解钾固氮肥，具有降解土壤中不能被植物利用的磷和钾的功效，将它施用到烟叶上对提高烟叶发酵增香的效果独特。它既是生产微生物肥料的常用菌种，也是制作水体处理剂的常用菌种。巨大芽孢杆菌对农业生产有很多好处，因此在农业上具有广阔的应用前景。芽孢主要是芽孢杆菌属Bacillus与梭菌属Clostridium中细菌产生的特殊休眠体，有极强的抗逆性，对多种不良条件有强耐受性。由于芽孢极强的抗逆性，使芽孢杆菌具有很好的应用前景，特别是在使用活菌制剂中表现出强大的生命力，是制备微生物菌剂的理想存在形式。巨大芽孢杆菌也有产芽孢的特性，但是与解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等容易形成芽孢的微生物菌株相比，还存在活菌量偏低、芽孢形成率不高、发酵周期偏长、生产成本高等问题。并且，芽孢的过早或者过晚生成会严重影响一些目的产物的生产和高浓度菌体的获得。
技术实现思路
本专利技术针对现有微生物肥料常用的巨大芽孢杆菌发酵技术的不足，造成芽孢产率不尚的冋题，提供一种尚芽抱率的巨大芽抱杆菌发酵方法，以提尚广品的芽抱含量，广品质量和使用效果。本专利技术的技术方案如下:—种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤:(1)将巨大芽孢杆菌活化后，接种于固体培养基上，经34?37°C静置培养2?3天，得二次活化后的巨大芽孢杆菌；(2)将步骤(1)制得的二次活化后的巨大芽孢杆菌接种于种子培养基中，在温度34?37°C，溶氧值20?70mg/L，发酵培养14?20小时，制得种子菌液；所述种子培养基按质量百分比，由如下组分组成:蔗糖1.40?1.80%、豆柏1.30?1.90%、碳酸钙0.02?0.05%、氯化钠0.30?0.60 %、磷酸氢二钾0.40?0.80 %、磷酸二氢钾0.20?0.40 %、酵母膏0.02?0.06 %、硫酸镁0.02?0.05 %、硫酸锰0.01?0.03 %、麸皮0.30?0.80 %、泡敌0.01?0.02 %，余量为水，pH 6.5?7.5 ;(3)将步骤(2)制得的种子菌液接种于发酵培养基中，在温度34?37°C，溶氧值20?70mg/L，发酵培养至18?22小时，按发酵液体积百分比的20%?25%添加补料液，继续发酵，发酵至24?32小时，制得巨大芽孢杆菌发酵液；所述发酵培养基按质量百分比，由如下组分组成:麸皮1.60?2.00%、豆柏1.50?2.00 %、碳酸钙0.05?0.1 %、氯化钠0.30?0.60 %、磷酸氢二钾0.40?0.80 %、磷酸二氢钾0.20?0.40 %、硫酸镁0.02?0.05 %、硫酸锰0.01?0.03 %、淀粉0.50?1.00%、泡敌 0.01 ?0.02%，余量为水，pH 6.5 ?7.5 ;所述补料液，组分如下碳酸钙2.0?5.0g/L，小麦次粉30?80g/L，余量为水。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，活化条件为:34?37°C活化培养2?3天。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，活化的活化培养基，组分如下:牛肉膏0.20?0.50 %、氯化钠0.30?0.80 %、蛋白胨0.80?1.20 %、琼脂1.80 ?2.00%，余量为水，pH 7.0 ?7.5 ;根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，固体培养基按质量百分比，由如下组分组成:牛肉膏0.20?0.50 %、氯化钠0.30?0.80 %、蛋白胨0.80?1.20 %、琼脂1.80 ?2.00%，余量为水，pH 7.0 ?7.5 ;根据本专利技术优选的，所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)选自:中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC1.223 ;中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:ACCC02991 ;中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:ACCC03031 ;中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:ACCC03044 ;中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号:ACCC03116之一。本领域技术人员均可以预料到，由于巨大芽孢杆菌具有共同的生物学特性，因此采用其他巨大芽孢杆菌进行替换后，也能达到相同的技术效果。—种巨大芽孢杆菌的芽胞化促进剂，组分如下，均为重量份:碳酸钙2?5份，小麦次粉30?80份。根据本专利技术优选的，所述的芽胞化促进剂，组分如下，均为重量份:碳酸钙3?4份，小麦次粉40?70份。本申请所述的培养基和补料液的灭菌条件均可采用本领域常规的灭菌条件:121°C、0.llMpa 灭菌 20 ?30min。有益效果本专利技术通过对培养条件及培养基成分的选择，同时在发酵的过程中添加巨大芽孢杆菌的芽胞化促进剂，提高了巨大芽孢杆菌活菌数和芽孢率，制得的发酵液中活菌数可以达到8.0X109CFU/ml以上，经结晶紫染色后油镜观察，芽孢率95%以上，可显著提高产品的芽孢数和产品质量。【具体实施方式】下面结合实施对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源:实施例1中所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为:ACCC 02991。实施例2中所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为:ACCC 03031。实施例3中所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为:ACCC 03044。实施例4中所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为:ACCC 03116。实施例5中所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为:CGMCC 1.223。实施例1—种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤:(1)将保存于_4°C的巨大芽孢杆菌斜面划线接种于斜面培养基上，37°C活化培养2天，制得活化后的菌体；活化培养基按质量百分比，由如下组分组成:牛肉膏0.30%、氯化钠0.50%、蛋白胨0.90%、琼脂2.00%，余量为水，pH 7.2 ；然后将活化后的菌体用无菌生理盐水洗下后接种于茄形培养瓶中的固体培养基上，37°C静置培养3天，制得二次活化后的巨大芽孢杆菌；固体培养基按质量百分比，由如下组分组成:牛肉膏0.30%、氯化钠0.50%、蛋白胨0.90%、琼脂2.00%，余量为水，pH 7.2 ；(2)将步骤(1)制得的二次活化后的巨大芽孢杆菌接种于种子培养基中，在温度37°C，溶氧值20?70mg/L，通气比例:起始通气比为1: 0.5，当溶氧值低于20mg/L时加大通气比为1:1，当溶氧值回升高于70mg/L时降低通气比，搅拌转数:起始为150rpm，根据溶氧值调整(溶氧值升高，降低搅拌转数；溶氧值降低，升高搅拌转数)最大搅拌不超过200rpm，发酵培养16小时，制得种子菌液；所述种子培养基按质量百分比，由如下组分组成:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将巨大芽孢杆菌经活化后，接种于固体培养基上，经34～37℃静置培养2～3天，得二次活化后的巨大芽孢杆菌；(2)将步骤(1)制得的二次活化后的巨大芽孢杆菌接种于种子培养基中，在温度34～37℃，溶氧值20～70mg/L，发酵培养14～20小时，制得种子菌液；所述种子培养基按质量百分比，由如下组分组成：蔗糖1.40～1.80％、豆粕1.30～1.90％、碳酸钙0.02～0.05％、氯化钠0.30～0.60％、磷酸氢二钾0.40～0.80％、磷酸二氢钾0.20～0.40％、酵母膏0.02～0.06％、硫酸镁0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.03％、麸皮0.30～0.80％、泡敌0.01～0.02％，余量为水，pH 6.5～7.5；(3)将步骤(2)制得的种子菌液接种于发酵培养基中，在温度34～37℃，溶氧值20～70mg/L，发酵培养至18～22小时，按发酵液体积百分比的20％～25％添加补料液，继续发酵，发酵至24～32小时，制得巨大芽孢杆菌发酵液；所述发酵培养基按质量百分比，由如下组分组成：麸皮1.60～2.00％、豆粕1.50～2.00％、碳酸钙0.05～0.1％、氯化钠0.30～0.60％、磷酸氢二钾0.40～0.80％、磷酸二氢钾0.20～0.40％、硫酸镁0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.03％、淀粉0.50～1.00％、泡敌0.01～0.02％，余量为水，pH 6.5～7.5；所述补料液，组分如下：碳酸钙2.0～5.0g/L，小麦次粉30～80g/L，余量为水。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王梅，江丽华，石璟，谭德水，徐钰，崔荣宗，魏建林，杨岩，李国生，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农业资源与环境研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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