一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法，包括：提取待测植株和对照植株的基因组DNA，加入引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，然后进行HRM分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株与对照植株对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，判定该待测植株编辑成功。本发明专利技术方法操作简便快速、有效、结果准确、高通量、使用成本低。利用本发明专利技术的方法辅助育种，能大大提高植株筛选效率。

【技术实现步骤摘要】

本项专利技术属于植物基因工程领域，尤其设及一种用于筛选祀向基因编辑植株的方 法。
技术介绍
在现代生物学研究中，基因组编辑（Genomicediting,G巧技术是人们了解和改良 基因功能的重要技术手段。基因组编辑技术的发展先后经历了锋指核酸酶狂incfinger nucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应物核酸酶（Transcriptionactivatorlike effectornucleases,TALENs)技术、和规律成簇间隔短回文重复blusteredregularly interspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技术。运些 人工核酸酶都可W在DM祀位点产生DM双链断裂值oublestrandbreaks,DSBs)，然后 利用生物本身拥有的非同源末端连接或同源重组两种不同的修复机制对DSBs进行修复， 实现对基因组的定点编辑。 其中，CRISPR/Cas系统是近两年来刚刚兴起但表现为最有应用前景的一项基因组 编辑（Genomicediting,GE)技术，它具有操作简便、效率高等特点，已在拟南芥、烟草、水 稻、高梁等植物中成功实现祀向诱变（参见：NucleicAcidsRes，2013,41(20):el88;rfet Biotech, 2013, 31 (8):688- 691 ;化tBiotech, 2013, 31 (8) :691 - 693)。其原理是利用祀点 特异性的RNA将化s9核酸酶引导到基因组上的具体祀点，从而对特定基因位点进行切割导 致突变。利用CRISPR/tas技术进行基因编辑有特异性、祀向性、可遗传性等优势。 因为植物和动物的细胞构造不同，植物有细胞壁，不能通过显微注射的方法获得 基因编辑植株，需要农杆菌介导。W水稻为例，由CRISPR/Cas技术获得基因编辑的植株步 骤是：设计两条单链oligo序列，退火形成双链DNA;将双链DNA连接到载体中，转化农杆 菌；农杆菌侵染水稻愈伤组织；愈伤组织分化长成待测植株。CRISPR技术可W在目标区段内引起不同类型的基因突变，多数为化P插入和小片 段缺失W及一个或多个碱基SNP(参见PNAS，2014, 111(12) :4632-4637)。在利用CRISPR/ Cas技术编辑产生的水稻突变群体中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，如：嵌合 体、杂合型、双等位基因突变、纯合型，不同类型突变植株的情况不同，因此需要采用特定的 方法对单株进行鉴别。目前，对单株进行鉴别的方法，主要包括有：祀位点直接PCR后TA克隆测序和基于 可W识别错配双链的错配内切酶检测法。克隆测序的方法是将祀序列PCR扩增后，把PCR 产物克隆到T载体中然后进行sanger测序，经测序后可W确切知道运条祀序列上的碱基 变化。克隆测序法灵敏度高，但是相比之下价格贵，时间长，一般的做法是把筛选出的阳性 植株进行测序验证。错配酶法的原理是祀序列经化s/gRNA切割后由于缺乏修复模板，将 主要W非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将祀序列PCR 扩增后经变性、退火，将形成错配，错配酶（主要是T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪 切（参见：化tGenet, 1995, 9:177-183 ;化1:ure, 2007, 449:621-624iQirrOpinStruct Biol, 2008, 18:86-95)dPCR产物经酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，看是否有切割条带，若出现切 割条带，则代表该植株被成功编辑。若没有出现切割条带，则代表该植株未被成功编辑。运 种方法比克隆测序的方法快速，花费少，但是灵敏度不如克隆测序法，且有假阳性的情况产 生。因此，对于CRISPR祀向编辑群体中的突变，目前仍缺乏一种准确率高、成本低廉、快速、 高通量的单株鉴别方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于筛选祀向基因编辑植株的方法，该方 法快速、准确率高、且成本低廉。 一种用于筛选祀向基因编辑植株的方法，包括： (1)W未经编辑的作物植株为对照植株，W经祀向基因编辑获得的作物植株为待 测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA; (2)根据与所述祀向基因编辑的祀位点相邻的基因组序列来设计引物，W所提取 的基因组DNA为DNA模板，加入所述引物和巧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含 编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200~50化P; (3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率烙解曲线化i曲ResolutionMelting,HRM) 分析，W对照植株所对应的高分辨率烙解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率 烙解曲线与对照植株所对应的高分辨率烙解曲线的最大巧光差异AF，若IAF| <0.05,视 为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若IAF| >0.05， 视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。 本专利技术方法中，所述祀向基因编辑是指CRISPR/Cas编辑。 本专利技术方法中，所述作物植株可W是任何植物，特别适用于水稻植株、玉米植株、 大丑植株等。 本专利技术方法中，所述作物植株为水稻植株时，提取水稻植株DNA时，可W采用水稻 的叶片、根等组织。对水稻植株DNA的提取方法也没有特殊要求，可W为CTAB法、SDS提取 法、TPS提取法等，也可W直接采用商用试剂盒，例如：博日的植物基因组DNA提取试剂盒、 天根的植物DNA提取试剂盒等，进行DNA的提取。 本专利技术方法中，所述的引物是采用特定的引物设计软件（例如Prime巧软件）来 设计的，优先选取特异性引物。所述特异性引物是指引物在待测植株基因组上是特异的，例 如，当植株为水稻时，所述引物在水稻基因组上是特异的。 本专利技术方法中，所述DNA模板可W为直接提取的单株待测植株的基因组DNA，也可 W是摩尔比为1:1的待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA的混合。 本专利技术方法中，所述DNA片段中GC含量过高时，采用GCbufferPCR扩增。 本专利技术方法中，所述DNA片段优选为200~40化口。 本专利技术方法中，对包含祀向编辑的祀位点的一段核巧酸序列设计特异性引物对， 进行PCR扩增后采用HRM检测，由于CRISPR/Cas祀向编辑是针对特定的位点进行突变， CRISPR/Cas祀向编辑成功的植株的DNA只在特定的祀位点上进行突变，而正常植株和未成 功编辑的植株则不会产生DNA的差异，从而实现基因分型。采用本专利技术方法进行筛选的结 果经测序验证，准确率高，假阳性低，表明本专利技术的筛选方法有效、结果准确。与现有技术相比，本专利技术具有W下有益的技术效果：[OOW(1)本专利技术的筛选方法中，HRM检测不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异 性探针，在PCR之后可直接用HRM检测，即可完成对样品突变的分析，省去了琼脂糖电泳等 步骤，该方法具有操作简便快速的优点。 阳02引似本专利技术的筛选方法中，CRISPR祀向编辑产生的各种突变类型均能与未编辑成 功的植株有效区分开来，假阳性较低，并且，经由测序验证其准确率高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选靶向基因编辑植株的方法，其特征在于，包括：(1)以未经编辑的作物植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的作物植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；(3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率熔解曲线分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊，舒庆尧，
申请(专利权)人：无锡哈勃生物种业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32