一种用于检测猪瘟病毒流行株的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含One Step RT-PCR buffer 、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，所述检测方法包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤及评定标准。本发明专利技术弥补了CSFV鉴别诊断上的薄弱环节，设计了特异性针对猪瘟强毒株的引物及探针，优化并组装成试剂盒，具有高度特异、敏感、简单、准确等特点，能快速、敏感、准确以及低成本地对猪瘟流行株病毒进行检测及定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及猪攝病毒检测
，具体说是一种用于检测猪攝流行株病毒的 化qmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本专利技术还包括该试剂盒的使用方法。
技术介绍
猪攝（Classicalswinefever,CSFO是由猪攝病毒（Hogcholeralapinized virus,肥LV)或Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病，是 危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织（01巧将其列入0IE名录，我国将其 列为一类传染病。近年来，我国猪攝的流行和发病特点发生了很大的变化，在临床表现上趋 于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患。石口株是 1945年在我国分离到的强毒流行株，也是我国攻毒用的标准强毒株，与兔化弱毒株同属于 1. 1亚型，运2株病毒的核巧酸和氨基酸具有很高的同源性。但是猪攝弱毒疫苗在中国的大 规模应用使猪攝流行毒感染和疫苗接种的区分变得非常困难。另外，母源抗体干扰和免疫 程序错误导致的免疫耐受也会引起CSF爆发。因此，急需建立一种可W准确诊断猪攝流行 毒株感染与疫苗接种的敏感、特异、重复性好的检测方法。 目前，用于检测猪攝病毒的方法有多种，如病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶单层 试验（IPMA)、间接免疫巧光试验（IFA)、酶联免疫吸附试验巧LISA)和血清中和试验（SN)、 免疫胶体金技术、反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR)、实时巧光定量PCR和基因探针等。巧 光定量PCR方法是近年来迅速发展起来的一种分子生物学方法，具有灵敏度高、特异性强、 重复性好、自动化程序高、定量检测微生物核酸拷贝数等优点。但是上述方法都是通用型 的，只能检测是否CSFV感染，无法区分检测到的毒株是疫苗株，还是田间流行毒株感染引 起，另外，运些方法都存在或操作复杂或敏感性低或漏检、假阳性等问题。导致接种疫苗存 在盲目性，进而加大了预防和监测CSFV的难度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于准确鉴别诊断猪攝流行 毒感染与疫苗接种的特异性检测的技术手段的难题，提供一种能够快速、敏感、准确W及低 成本的用于检测猪攝病毒流行株的化qmanReal-timeRT-PCR试剂盒，本专利技术还提供该试 剂盒的使用方法，本试剂盒及使用方法还适用于检测低微含量的猪攝病毒流行株病毒。 为解决上述问题，本专利技术采用了下述技术方案： -种用于检测猪攝流行株病毒的化qmanReal-timeRT-PCR试剂盒，所述试剂盒 包含化eStepRT-PCRbuffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列沈QIDN0:1和沈Q IDNO:2的引物及沈QIDNO:3的探针引物的混合物。 所述序列沈QIDNO: 1至沈QIDNO:2的引物混合物包括： 沈QIDN0:1 :上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTAATTTTT沈QIDN0:2 :下游引物TTACCTTAGTCCAACTGTGGACGT 探针引物序列为：沈QIDN0:3:ATTTATTTAGGTATTACTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAG 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告巧光基团、3'端标记物为TAMRA泽灭巧光 基团。[001引SEQIDNO: 1至沈QIDNO:2的由5'端向3'端延长的序列：沈QIDN0:4(180bp):ggaccctattgtagataacactaatttttatttatttaggtattactatttatttatttatttatttat tg曰曰tg曰gt曰曰g曰曰ctggt曰c曰曰曰ct曰cctc曰曰gtt曰cc曰c曰ct曰c曰etc曰ttttt曰曰c曰gc曰cttt曰gctgg曰曰gg曰曰曰曰ttcctg曰cgtcc曰c曰gttgg曰ct曰曰ggt曰曰ο 所述阴性对照为无RNA酶水。 所述阳性对照为含有猪攝流行株基因序列的阳性质粒pGM-180,其构建方式如 下：a.猪攝流行株基因组RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit说明书进行操作。 W提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA。WSEQIDN0:l及SEQIDN0:2作为引物 扩增，反应条件为94°C预变性5min;94°C变性50s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共30个循 环；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR产物于lOg/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。b.PCR产物的克隆及序列分析 PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含lOOmg/L氨节青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列 测定正确的质粒命名pGM-180,应用Nano化OP2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为 286ng/ul，计算出其拷贝数为9. 2xl〇i°(copies/ul，拷贝数/微升），本专利技术的试剂盒利用 9. 2xl〇e(copies/ul)浓度的质粒作为阳性对照W及利用其倍比稀释后制作为标准曲线。 本专利技术还提供了所述试剂盒的使用方法，包括W下步骤： 实时巧光定量RT-PCR，扩增条件如下： 42°(：反转录5111111;94°(：预变性2111111;941：2〇3，退火溫度511：3〇3,721：2〇3,40个 循环。 根据扩增结果，判定标准为：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值>35为阴性。也可W依扩增得到的Ct值 根据标准曲线对样品进行准确定量。 使用所述试剂盒进行实时巧光定量RT-PCR，反应体系如下：a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；[002引b.引物浓度为1化mol/μ1的Ξ条引物混合液3份，其中180bp上游引物1份， 180bp下游引物1份，探针引物1份；[002引 C.酶混合物1份；d.无RNA/DNA酶水 5. 5 份；e.提取样品的RNA模板3份；[003引f.阳性对照pGM-180阳性质粒3份；[003引 g.阴性对照无DNA酶水3份。 本专利技术弥补了CSFV鉴别诊断上的薄弱环节，设计了特异性针对猪攝强毒株的引 物及探针，优化并组装成试剂盒，具有高度特异、敏感、简单、准确等特点。在使用过程中将 反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的 1-2小时，从而有利于快速检测。与普通PCR相比，灵敏度高，对模板浓度要求较低，可用于 检测低微含量的猪攝病毒，无需电泳就可直观的反应检测结果，避免了漠化乙锭对人体健 康的危害。本专利技术使用了探针法，只有探针引物特异的结合到扩增的祀序列上时才会产生 有效的结果，巧光定量可W看到整个扩增过程、扩增效率、溶解溫度，而且利用已知起始拷 贝数的标准品直接得到标准曲线，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数，进行精确定量。本专利技术有助于猪攝流行株的防控和隐性带毒动物的剔 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测猪瘟病毒流行株的Taqman Real‑time RT‑PCR试剂盒，所述试剂盒包含One Step RT‑PCR buffer、酶混合物、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物及SEQ ID NO:3的探针引物的混合物，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的引物序列为：SEQ ID NO:1：上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTAATTTTTSEQ ID NO:2：下游引物TTACCTTAGTCCAACTGTGGACGT 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田宏，吴锦艳，尚佑军，陈妍，王光祥，郑海学，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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