本发明专利技术涉及一种改造的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm的重组表达及其应用。以中国明对虾抗脂多糖因子FcALF2为原型进行改造，改造后的抗菌蛋白命名为ALFm，由SEQ ID No.1碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成。本发明专利技术利用表达载体pPIC9K和表达菌株毕赤酵母GS115，对ALFm进行真核重组表达，并获得了具有生物学活性的重组蛋白。对其生物学功能进行体外验证，证实该重组蛋白能够对多种细菌和WSSV病毒产生有效的抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是涉及一种改造后的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm的重组表达和应用。
技术介绍
对虾养殖是海水养殖的支柱产业之一，随着市场对优质水产品需求量的不断增长，虾类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。然而，虾类病害的爆发性流行使对虾养殖遭受了巨大损失，多种细菌病毒引发的对虾疾病频发困扰着对虾养殖业的发展。目前抗生素、激素类等药物在水产养殖上，虽然对病害控制起到一定的作用，但也破坏了水环境及动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，同时抗生素的滥用也将导致细菌产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大的致病微生物。因此开发特异的生物制品药物来替代传统抗生素的任务十分紧迫。对虾抗菌肽是一类基因编码的小分子多肽，在先天性免疫中起到了重要作用。它们，一般带有正电荷，能够对某些细菌、真菌和病毒等具有较强的杀伤作用。同时，与传统抗生素相比，抗菌肽作为多肽抗生素具有无污染，针对性强，不易产生耐药性等特点，是解决对虾病害问题的重要突破口。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharidefactor，ALF)作为甲壳动物的一类抗菌肽，具有广谱的抗菌活性以及识别结合脂多糖的能力，作为先天性体液免疫的重要效应分子，可以直接杀灭病原，在先天性免疫反应中起着至关重要的作用，也是近年来抗菌肽类的研究热点。在前期的研究中，申请人所在项目组分析了7种中国明对虾不同功能域(LPSbindingdomain)的抗菌及抗病毒活性，并通过结构改造证实了其关键的氨基酸位点和结构特征。一种以FcALF2的LPS结合结构域为原型，经过改造后的短肽CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC表现出了较强的抗菌活性。但是使用化学方法合成小肽的成本高，产量少。而利用生物工程的手段，通过工程菌株，则能够分离纯化出具有生物活性的，大量的ALF功能域小肽，成体较低，可以用于大规模制备。
技术实现思路
目的在于提供一种抗菌蛋白基因的改造方法及其高效重组表达和应用。本专利技术技术方案如下：改造后的抗菌蛋白ALFm基因：具有序列表SEQIDNo.1中的碱基序列及SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。所述ALFm基因的重组表达：进行密码子优化并合成ALFm基因，构建真核重组表达载体pPIC9K-ALFm，电转化到酵母菌株，鉴定阳性克隆，并通过甲醇诱导表达，筛选出表达量较高的菌株，通过Ni2+亲和层析柱，纯化出具有活性的重组抗菌蛋白，并检测其活性；具体为：1.基因的改造和合成用氨基酸序列CKFKVKPKFKRWKLKFKGRMWC替换来源于中国明对虾FcALF2基因(基因注册号：JX853775)编码氨基酸序列中的CSFNVTPKFKRWQLYFRGRMWC序列，获得具有SEQIDNo.2所示氨基酸序列的ALFm蛋白序列，并在3’末端加上组氨酸标签序列，将其反译成核苷酸序列，并根据酵母表达的密码子偏好性，进行密码子优化，获得SEQIDNo.1所示的碱基序列(图1)。2.重组表达载体及宿主菌的选择确定使用pPIC9K为真核表达载体，使用毕赤酵母GS115为表达宿主菌。3.重组表达载体的构建利用内切酶将目的基因从pUC57上剪切下来，连入到pPIC9K载体中，构建重组表达载体pPIC9K-ALFm，将其转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用PCR技术检测阳性菌株(图2)。4.转化与筛选大量提取重组表达载体pPIC9K-ALFm，用SalI内切酶单酶切表达载体，并电转化到酵母菌GS115中，挑选单克隆菌，进行PCR检测，筛选出阳性工程菌(图3)。5.甲醇诱导表达小试挑选阳性克隆，在BMMY液体培养基中培养，用甲醇进行诱导，使用Dot-Blot(Anti-His抗体)来检测上清中的蛋白表达，筛选高表达菌株进行扩大培养。6.扩大培养及重组蛋白分离纯化选择用Dot-Blot检测表达量高的菌株，进行扩大培养。用甲醇进行诱导表达，72h后离心收集上清，经PEG20000浓缩后，用Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱进行纯化，收集流出液，并将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(pH7.4)进行过夜透析，并用12％SDS-PAGE电泳分析(图4A)。7.Western-blot和质谱检测将纯化后的蛋白质进行电泳检测，并转到PVDF膜上，由于ALFm蛋白含有His标签，用HRP标记的抗His标签抗体进行Western-blot检测(图4B)。同时对纯化后的蛋白进行MALDI-TOF-MS检测，分析重组蛋白分子量(图5)。所述的改造后的抗菌肽重组蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌的生长均具有抑制作用，同时该重组蛋白与WSSV病毒孵育后，能显著抑制病毒的感染活性。本专利技术有如下优点：1.本专利技术对一种中国明对虾抗菌蛋白基因FcALF2的功能域进行替换改造后，反译成核苷酸序列，并进行密码子优化，更有利于目的序列在酵母中进行重组表达。2.利用本专利技术中使用的重组表达载体及宿主菌，能够成功表达出具有抗菌和抗病毒活性的重组蛋白。3.意义深远。本专利技术可开发有效的对虾细菌性和病毒性疾病的防治制剂。同时，为其他具有抗菌活性蛋白的重组表达研究提供了新的思路。附图说明图1ALFm的序列信息，(A)ALFm的核苷酸和氨基酸序列；(B)重组ALFm蛋白的结构；(C)ALFm序列密码子偏好性检测；图2重组质粒pPIC9K-ALFV的PCR检测；图3PCR检测重组酵母菌GS115-pPIC9K-ALFV；图4重组表达蛋白ALFm的SDS-PAGE检测和Western-Blot检测，A，LaneM：ProteinMarker；Lane1：诱导后72小时；Lane2：流出液；Lane3：洗脱液；B，western-blot检测ALFm表达；图5ALFm纯化蛋白的质谱鉴定；图6利用抑菌圈法检测重组蛋白ALFm的抑菌活性；A大肠杆菌；B溶藻弧菌；C芽孢杆菌；D藤黄微球菌；图7重组蛋白ALFm抗WSSV活性。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例改造后的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm，具有如下序列：(1)SEQIDNo.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度：327碱基对*类型：核酸*链型：双链*拓扑结构：线性(b)分子类型：cDNA(c)假设：否(d)反义：否(e)最初来源：中国明对虾(Fenne本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改造的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种改造的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm，其特征在于：具有序列表SEQIDNo.1中
的碱基序列及SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述中国明对虾蛋白ALFm的编码基因，其特征在于：具有序列表SEQ
IDNo.1中的碱基序列。
3.一种按照权利要求1所述改造的中国明对虾抗菌蛋白基因ALFm基因的重组表达，其
特征在于：将FcALF2(NCBIaccessionnumber:JX853775)基因的功能域脂多糖结合区域
进行改造，反译成核苷酸序列，对密码子进行优化，合成该改造后的基因序列SEQIDNo.1，
构建真核表达载体，利用酵母表达体系，获得有活性的重组抗菌蛋白SEQIDNo.2。
4.一种按照权利要求1所述中国明对虾蛋白ALFm基因的重组表达，其特征在于：
1)基因的合成
将SEQIDNo.1中的核苷酸序列进行体外合成，连接于pUC57克隆载体中；
2)重组表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：李富花，杨辉，李诗豪，相建海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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